1、基金项目：海南省卫生健康行业科研项目（）；海南省自然科学基金高层次人才项目（）；海南医学院大学生创新创业训练计划项目（）通讯作者：王颖【基础医学】姜黄素对高糖诱导人肾小管上皮细胞线粒体自噬的影响常江，王颖，李永妍，赖连英，杨时旭，李玉洁（海南医学院第一附属医院肝胆外科，海南 海口 ；海南医学院第一附属医院全科医学科；海南医学院）摘要 目的：观察姜黄素（，）对高糖环境下人肾小管上皮细胞（，）线粒体自噬及氧化应激的影响，探究姜黄素对 细胞的保护作用及机制。方法：体外培养 细胞，随机分为组：对照组（葡萄糖）、姜黄素组（葡萄糖 姜黄素）、高糖组（葡萄糖）、姜黄素高糖组（葡萄糖 姜黄素）。各组干预刺激
2、，收集细胞的总蛋白，采用 检测线粒体自噬相关蛋白 、以及 的表达；检测各组线粒体膜电位水平；采用活性氧检测试剂盒检测细胞内活性氧（，）生成情况。结果：与对照组比较，姜黄素组各项指标无明显改变（）；与姜黄素组比较，高糖组 、蛋白表达降低（），细胞内 表达升高（），线粒体膜电位活性下降（）；与高糖组比较，姜黄素高糖组 、蛋白表达升高（）；细胞内 表达降低（）；线粒体膜电位活性升高（）。结论：姜黄素可逆转高糖诱导的 细胞线粒体自噬，抑制氧化应激。关键词 姜黄素；高糖；线粒体自噬；人肾小管上皮细胞 ：，（，；，）：（），：（），（），（）年第 卷第 期 （），（）：，（），（），（），（），（），（）
3、，（）：；糖尿病肾病（，）是糖尿病最常见的微血管并发症，在其发展过程中如不予干预，可进展至终末期肾脏病。发病机制比较复杂，早期临床防治难度大。自噬功能障碍与 发病有密切关系，线粒体自噬可以特异性选择并清除受损或老化的线粒体，减少细胞内 ，从而维持机体自身稳态。姜黄素是诸多中药的天然药物成分，为酸性多酚类物质，有极其广泛的药理作用，如抗凝、抗肿瘤、降血脂、抗氧化、抗炎等。目前已发现姜黄素对肾脏病变具有一定的治疗作用，且不良反应小、使用安全，已成为研究的热点。但是，姜黄素对 的保护作用及机制并不明确。本研究观察姜黄素对高糖环境下人肾小管上皮 细胞线粒体自噬以及氧化应激的影响，为进一步研究 的有效中
4、药治疗提供重要的理论来源和依据。对象和方法 材料与试剂 细胞购自美国 （，细胞库）；低糖 培养基（美国 公司）；蛋白浓度测定试剂盒（北京 公司）；兔抗人 多克隆抗体、兔抗人 多克隆抗体、兔抗人 多克隆抗体、鼠抗人 多克隆抗体、兔抗人 多克隆抗体（美国 公司）；姜黄素（美国 公司）；葡萄糖（美国 公司）；线粒体膜电位（）检测试剂盒（北京索莱宝生物技术有限公司）；试剂盒（南京建成生物工程研究所）；检测试剂盒（日本同仁公司）。姜黄素对 细胞安全有效浓度的筛选采用细胞计数试剂盒（，）检测 细胞活力，探讨姜黄素的最佳药物浓度。对照组细胞予 培养基，该培养基葡萄糖（）浓度为 ；高糖培养基的配制首先用 培养
5、基溶解 葡萄糖，过滤后配成母液，然后按一定比例加入 培养基中，使其葡萄糖终浓度为 。用 胰蛋白酶进行细胞消化后，在 孔板中以 个细胞 孔密度接种细胞，随机分为 组：对照组（），姜黄素高糖组（），姜黄素高糖组（），姜黄素高糖组（），姜黄素高糖组（），姜 黄 素 高 糖 组（），姜黄素高糖组（），处理细胞 。根据说明书要求，将细胞进一步在新鲜培养基中培养 ，然后将 溶液分别加入到每孔培养基中。将培养板放置在、环境中培养 。酶标仪检测 处的吸光度值，选择姜黄素最佳浓度用于后续实验。年第 卷第 期 细胞培养及实验分组 细胞接种于 培养基中培养，培养箱条件 、，隔日换液，待细胞生长至 时进行传代。将实验
6、 细胞随机分为 组：细胞接种于 葡萄糖的 培养液中培养，记为对照组（）；对照组加入 姜黄素共培养，记为姜黄素组（）；细胞接种于 葡萄糖的培养基中培养，记为高糖组（）；高糖组加入 姜黄素共培养，记为姜黄素高糖组（）。干预 后进行各项实验。蛋白质印迹法检测 、蛋白表达使用 裂解缓冲液溶解 细胞，离心（、），蛋白质浓度测定按照二辛可酸（，）蛋白定量检测试剂盒说明书操作。十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶（，）电泳分离蛋白，将分离的蛋白凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜（，），膜被封闭在 脱脂奶粉中，温箱孵化 ，封闭一抗过夜。本研究使用的主要抗体为：（，）；（，）；（，）；（，）；（，）。洗涤次后，用二抗（）室温封
7、闭，利用 软件分析各条带灰度值。线粒体膜电位的检测按线粒体膜电位检测试剂盒（）说明书进行操作，对于 孔板的个孔，吸除培养液，用 洗涤细胞 次，加入 细胞培养液，细胞培养箱中用 染色工作液 标记 细胞 ，之后吸除上清，用 染色缓冲液（）洗涤 次，加入 细胞培养液，培养液中含有血清和酚红，应用激光共聚焦显微镜观察其荧光图像。激发光设置为 ，发射光设置为 。线粒体膜电位较高时，产生红色荧光，线粒体膜电位较低时，产生绿色荧光。通过 从荧光颜色的转变检测线粒体膜电位的变化。细胞内 的检测根据产品说明书，用活性氧测定试剂盒对活性氧生成进行评价。不同分组 细胞在含有 ，二氯荧光素二乙酸酯（，）且最终浓度 的
8、不同培养基中培养 。在、的二氧化碳培养箱孵育 ，多聚甲醛固定，在 冰箱里放置 。细胞内非特异性酯酶去乙酰化后，被 氧化生成荧光化合物 ，二氯荧光素（，）。采用流式细胞术检测 荧光强度，采用 软件进行分析。统计学方法所有实验均重复 次，符合正态分布的计量资料以均数 标准差（）表示，采用 统计学软件分析数据，采用单因素方差分析（）对多组间差异进行比较，两两比较采用 检验，以 为差异具有统计学意义。结果 实验结果通过 实验筛选姜黄素最佳药物浓度。与对照组相比，姜黄素高糖组细胞活性减低（）；高糖环境下不同浓度姜黄素组间比较，姜黄素组细胞活性最高（），筛 选 姜 黄 素 最 佳 药 物 浓 度 为 。见
9、图 。图 实验选择姜黄素最佳药物浓度注：为 ，为 各组 细胞 检测结果与对照 组 比 较，姜 黄 素 组 各 项 指 标 无 明 显 改 变 年第 卷第 期 （）；与姜黄素组比较，高糖组 、蛋白表达降低（）；与高糖组比较，姜黄素高糖组 、蛋白表达升高（）。见图 。各组 细胞线粒体膜电位检测结果与对照组比较，姜黄素组荧光强度无明显改变（）；与姜黄素组比较，高糖组细胞相对荧光强度比值降低（）；与高糖组比较，姜黄素高糖组细 胞 相 对 荧 光 强 度 比 值 升 高（）。见图 。图 免疫印迹显示各组 细胞 、蛋白的表达注：免疫印迹结果；：相对表达量条图；：相对表达量条图；：相对表达量条图；：相对表达
10、量条图；为 图 荧光探针检测各组 细胞线粒体膜电位水平注：为 ，为 各组 细胞 检测结果与对照组 年第 卷第 期 比较，姜黄素组 水平无明显改变（）；与姜黄素组比较，高糖组 水平升高（）；与高糖组比较，姜黄素高糖组 水平降低（）。见图 。图 各组 细胞 水平检测注：为 讨论 是糖尿病的微血管并发症之一，是导致终末期肾脏病的主要原因，在全球范围内其致残率及病死率均高 。而 的发病机制比较复杂，目前研究仍未完全阐明，致使其临床防治难度较大 。因此，探索天然药物成分缓解和改善糖尿病肾病已成为目前研究的重点，对提高 患者的生活质量，延长其生存时间及减少患者的支出具有非常重要的作用。的早期肾脏病变可见肾
11、小球超滤过和肥大，肾小管损伤也是 的早期变化和特征，与其进展关系密切，阻断肾小管上皮细胞受损可能更接近于 治疗的源头 。状态下肾小管损伤的主要病理改变为肾小管萎缩、肾小管上皮细胞凋亡、周围炎症细胞浸润及转分化等。其主要分子机制为高糖及糖代谢产物、蛋白尿、氧化应激等诱导细胞内信号通路异常激活，产生增多，释放出许多细胞因子，引起肾小管损伤 。线粒体是 产生的主要细胞器，高糖所致的线粒体 过多是肾小管损伤的核心 。自噬功能障碍与 发病密切相关，自噬有助于把损伤和老化的细胞结构进行生理性移除，同时促进细胞存活，维持组织的内稳态 。线粒体自噬属于巨自噬，其机制是通过自噬及时清除受损或不需要的线粒体，并且
12、与溶酶体融合，进而降解损伤线粒体，维持机体 平衡 。自噬效应蛋白 和微管相关轻链蛋白 均是重要的自噬标记蛋白，且 的含量与自噬的程度成正比。因此本研究通过 检测 和 在正常及高糖环境下的蛋白表达，观察姜黄素对其影响。线粒体自噬主要与 通路、和 受体介导有关 。有研究证明，通路激活，可改善 足细胞线粒体自噬，减轻足细胞损伤 ，。状态下，通路在肾小管上皮细胞的表达变化仍未明确，因此，本研究进一步检测 、蛋白表达，以观察高糖诱导的肾小管上皮细胞线粒体自噬相关通路，探讨姜黄素的可能作用机制。姜黄素是天然存在的一种生物活性多酚，具有抗氧化、清除氧自由基、抗炎、抗肿瘤等多方面药理 年第 卷第 期 作用 ，
13、因其具有强大的抗炎能力，被应用于各种炎症性疾病的治疗，如糖尿病、阿尔兹海默病等 。有研究发现，姜黄素可改善 大鼠肾脏细胞和尿液单核细胞趋化蛋白 （，）的表达，抵抗局部炎症扩散和发展，改善大鼠肾功能 。短期口服姜黄素可通过上调核受体转录因子（，）系统和抗炎作用进而降低糖尿病患者的蛋白尿 。姜黄素可增强 和线粒体标志物 的共定位，改善脑缺血 再灌注诱导的线粒体自噬 。但是，姜黄素是否可影响高糖诱导的 细胞线粒体自噬，以及可能机制未明确，仍有待研究。在本研究中，我们以 细胞为研究对象，应用高糖刺激，加用姜黄素干预。实验用来选择姜黄素最佳药物浓度，姜黄素可显著提高高糖环境下 细胞活性，故后续实验选择
14、姜黄素作为干预剂量。结果发现，高糖环境可抑制 细胞线粒体自噬，细胞内 产生增加。姜黄素对正常糖浓度的 细胞无明显影响，但可改善高糖环境下 细胞线粒体自噬，缓解氧化应激，具体表现为高糖环境下 细胞加用姜黄素后，、蛋白表达显著升高，检测细胞相对荧光强度比值升高，水平减低。姜黄素对糖尿病肾病的保护机制可能为增加 细胞线粒体自噬活性，激活 通路，同时对抗氧化应激。参考文献 ：，：，（）：，（）：，：，：张翠，常保超 自噬与糖尿病肾病的研究进展 中国中西医结合肾病杂志，（）：，：，（）：于柏松，刘冰 在糖尿病肾病中的研究进展 广东医学，（）：，：，（）：余美荣，蒋福升，丁志山 姜黄素的研究进展 中草药，（）：，：潘国伟，陈琨，马拥军，等 姜黄素对糖尿病肾病大鼠肾功能及肿瘤坏死因子 及单核细胞趋化蛋白 的作用 中国中医急症，（）：刘勇，邵丽丽，刘洁婷，等 姜黄素治疗糖尿病肾病研究进展 中国药业，（）：，（）：（收稿日期：）年第 卷第 期