1、724安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y；58(5)网络出版时间：2023-04-21 10：31：26 网络出版地址:h t t ps:/k n s.c n k i.n et/k c ms/d et a il/34.1065.R.20230420.1338.004.h t mlSigirr缺失调控NF-kB并参与慢性肾病小鼠发生肾间质纤维化童子文打徐德苹打王 詰蔦杨 萍1,涂珍珍1,臧丹丹彳,周海胜“摘要 目的 研究Sig ir r基因缺失小鼠在慢性肾病(CKD)并发肾间质纤维化(RIF)中的作用和机制。方法利用 P
2、 CR鉴定正常基因型(Sigirr*八)小鼠和Sigirr基因缺失(弘 girr-7-)小鼠。含0.2%高腺瞟吟饲料喂养小鼠，连续喂养 12周，以建立慢性肾脏损伤并发RIF模型。收集小鼠眼框 静脉血以检测肾功能;利用HE染色分析肾脏组织病理变 化，通过Ma ss o n染色观察肾脏纤维化程度，利用IHC和 West er n bl o t检测白细胞介素(IL)-1队My D88和NF-kB等信 号分子变化，同时观察转化生长因子(TGF)-R1、E-c a d h er in 和Vime n t in的表达变化。结果 肾功能检测结果显示高腺 瞟吟喂养小鼠的血清肌酹和尿素氮较对照组增加；HE和 M
3、a s so n染色结果显示：与Sigirr 4小鼠比较，Sig ir r_/_小鼠 的肾组织中，炎症细胞浸润和胶原纤维沉积更明显。IHC和 West er n bl o t结果显示IL-10及其下游的My D88表达增加，P-P 65水平显著增加；Sig ir r-小鼠的肾组织中IL-10、My D88、p-P 65等变化较Sig ir r+小鼠显著；同时TGF-01显 著增加，且Vimen t in的表达增加,E-c a d h e r in的表达明显降 低,West er n bl o t 检测 Vime n t in E-c a d h er in 结果与免疫组化一-致，且a-SMA也
4、显著升高。结论高腺瞟吟饮食可以建立 CKD并发RIF小鼠模型。Sigirr的缺失增加肾间质IL-ip介 导NF-kB信号通路的活化，促进TGF-pi表达，有利于上皮-间质细胞转分化相关RIF过程。关键词Sig ir r基因；慢性肾病;肾间质纤维化;IL-1|3；NF-kB 中图分类号R34文献标志码A 文章编号1000-1492(2023)05-0724-07 d o i:10.19405/j.c n k i.issn l OOO-1492.2023.05.004单一免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关受体(sin g l e immu n o g l o bu l in in t er l eu
5、 k in-1 r el a t ed r ec ept o r,SIGIRR)介导的信号通路具有抑制白细胞介素(in-t er l eu k in,IL)-1的活性。前期研究发现NF-kB/SIGIRR负调控IL-l p诱导的肾小管上皮-成纤维 细胞转分化。研究RY证实在IL-1的刺激下，SI-2022-11-25 接收基金项目：国家自然科学基金(编号=82071832)作者单位:安徽医科大学1生物化学教研室、2基础医学院、3科研实验中心，合肥230032作者简介:童子文,男,硕士研究生；周海胜,男,教授,博士生导师，责任作者,E-ma il：h a ish en g s a h mu.ed
6、 u.c nGIRR以配体依赖性方式与IL-1受体复合物相互作 用 o 肾间质纤维化(r en a l in t er st it ia l f ibr o sis,RIF)是慢性肾脏病(c h r o n ic k id n ey d isea se,CKD)发展过 程中常见的病理改变，其发病机制是与炎症因 子、细胞因子和转化生长因子(t r a n sf o r min g g r o w t h f a c t o r,TGF)-pi等活化相关信号通路有关。目 前研究CKD并发RIF的模型主要是通过单侧输尿 管的结扎术诱发的急性肾损伤的大鼠模型。但 其与临床上常见的慢性肾病并发RIF的过
7、程具有较 大差异性。为探讨SIGIRR在CKD并发RIF中的作 用,该研究拟使用Sjg ir r基因敲除小鼠(Sigirr j 在高瞟吟饮食诱发肾脏慢性损伤，建立CKD并发 RIF小鼠模型，观察RIF的病理特点及SIGIRR在 RIF发生过程中作用和机制。1材料与方法1.1主要试剂 野生型C57BL/6(S泗疗+八)小鼠、Sigirr-7小鼠购自南京集萃药康股份有限公司，饲 养于SP F级的动物房，饲养条件为恒温(22 2)咒，湿度60%,明暗周期为12 h/12 h,小鼠体质量(22 2)go所有动物实验均遵循实验动物护理和使用 指南和安徽医科大学伦理指南(伦理号:LISC20200007)
8、o 鼠源 E-c a d h er in 抗体、兔源 Viment in 抗体、兔源a-SMA抗体、兔源P 65抗体、兔源p-P 65抗体、抗鼠或兔抗体购买于美国Cel l Sig n a l in g Tec h n o l o g y公司。鼠源IL-1|3抗体、兔源TGF-R1抗 体购自武汉三鹰生物技术有限公司。鼠源p-p65抗 体购自上海圣克鲁兹生物技术有限公司。琼脂凝胶 糖粉购自于北京擎科生物科技有限公司。免疫组织 化学试剂盒、DAB显色液均购自北京中杉金桥生物 技术有限公司。改良Ma sso n三色染色液购自北京 索莱宝科技有限公司。正常小鼠饲料和含有0.2%腺瞟吟的高腺瞟吟饲料均购
9、自于无锡戴茨生物科技 有限公司。P CR试剂购自南京诺唯赞生物科技股 份有限公司。用于P CR检测小鼠基因组DNA的 Sigirr 敲除引物：P l：5TTCCAGTAGTCGGTTCTGA-ACTCAG-3,P 2：5z-TGTGGAGGTC AAACCTCTTAGG-3Z,P CR扩增产物为900 bp；用于P CR检测野生型 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2023 Ma y;58(5)725 Sigirr 的引物：P 3：5-AGCCTAAATCTGCAATCTCTC-CC3,P 4：5，-GAAACCTGTGCCCTAATC
10、CATG3,P CR扩增产物为496 bp；引物均是由北京擎科生物 科技有限公司合成。1.2 CKD并发RIF小鼠模型的建立 取7 8周 龄的Sigirr+/+小鼠和Sigirr 小鼠各8只，均为雄 性小鼠。将小鼠随机进行分组，包括高腺瞟吟喂养 组:即高腺瞟吟饲料喂养12周（4只Sigirr+/4只 Sigirr7-鼠）；正常饲料喂养的对照组:正常饲料喂 养 12 周（4 只 Sigirr+/+、4 只 Sigirr鼠）。12 周 后,异氟烷麻醉小鼠,眼眶静脉丛采血用于后续生化 分析,处死,取两肾脏分别固定于4%多聚甲醛和放 在-80兀冰箱中,备用。1.3各组小鼠肾组织病理学检查小鼠肾组织常
11、规脱水包埋、切片，烤片、脱蜡至水。进行HE染色 和Ma sso n染色,中性树脂封片，镜下观察拍照。1.4 免疫组织化学分析（immunohistochemistry a-nalysis.IHC）切片脱蜡至水，利用柠檬酸盐缓冲 液进行抗原修复，3%过氧化氢溶液覆盖组织阻断 过氧化物酶,4七孵育一抗过夜，孵育增强剂，孵育 二抗,DAB显色，苏木精核染,盐酸酒精分化,脱水 封片，拍照分析。1.5 Western blot实验 取冻存小鼠肾组织每组 50 mg,裂解液提取总蛋白，配置10%SDS-P AGE 胶,每孔蛋白上样6以,电泳分离、转膜，然后5%脱 脂奶粉室温下封闭2 h,4七孵育一抗过夜,
12、洗膜。对应二抗室温孵育2 h,洗膜、蛋白条带加ECL曝光 显色。用凝胶图像处理系统（Ima g e J软件）得出灰 度值。1.6小鼠基因型的PCR鉴定 剪去一段小鼠鼠 尾，常规提取鼠尾的基因组DNA作为模板。扩增结 束，对P CR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。1.7统计学处理 采用SP SS 19.0软件进行统计 分析，数据采用%s表示，组间比较使用单因素方 差分析,P 0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 Sigirr 7小鼠基因型鉴定 提取S輕77-八小 鼠和Sigirr+/+小鼠鼠尾基因组，分别利用敲除引物 和WT引物进行P CR扩增。结果显示Sigirr7-小 鼠基因组在P 1-P
13、 2引物扩增后900 b p特异条带，但 P 3-P 4引物扩增显示阴性结果;S翻严+小鼠基因组 在引物扩增获得496 b p的特异性条带，而P l-P 2引 物扩增未出现条带（图1）。因此，拟建立模型的小 鼠为C57BL/6品系Sigirr-7-和S翻r*八纯合小亂2.2 CKD并发RIF小鼠模型的建立及相关指标 比较 按照图2A的方案，采用高腺瞟吟饲料和正 常饲料喂养Sigirr-小鼠和Sigirr+/+小鼠,持续时 间为12周。观察发现:高腺瞟吟饲料喂养小鼠的肾 脏颜色显示黄白色，硬度较对照组明显增加;且肾脏 内含大量积液，液体呈黄褐色浑浊样,并有明显的肾 肿胀伴有颗粒状和肾盂积水现象,
14、对照组小鼠肾脏 肉眼未见异常（图2B）。肾功能检测结果显示两组小鼠血清尿素氮和肌 12345678C 9 10 11 12 13 14 15 16 C M bp引物1 引物2图1 PCR鉴定小鼠鼠尾基因组DNA的Sigi/r基因敲除弓I物用于P CR鉴定Sig ir r基因敲除的小鼠基因型;WT弓|物用于检测正常基因型的小鼠基因组;1 8泳道：8只Sig in基因缺失小鼠鼠 尾基因组DNA的P CR扩增结果;9-16泳道：8只正常基因型小鼠鼠尾基因组DNA的P CR扩增结果;C：空白对照组；M：DNA Ma r k er726安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medici
15、nalis Anhui 2023 Ma y;58(5)酹比较差异有统计学意义（F=92.10,P 0.001；F=16.5,P 0.001）。与高瞟吟喂养Sigirr+/+组小 鼠比较，高瞟吟喂养组Sigirr-7-小鼠血清尿素氮水 平升高，差异有统计学意义（均P 0.01）o与正常 饲料喂养组Sigin*小鼠和Sigirr-小鼠比较，高 瞟吟喂养组Sigirr+/+小鼠和Sigirr小鼠的血清尿 素氮（均 P 0.001）和肌 f f（P 0.05,P 0.01）水 平升高，差异有统计学意义（图2C、D）。HE染色显示对照组的小鼠肾组织形态及结构 正常，在高瞟吟喂养组小鼠肾脏中观察到肾小管扩
16、 张和大量炎性细胞浸润且出现肾小球硬化等形式的 肾损伤，且Sigirr-7小鼠肾脏组织中，炎性细胞浸 润、小球充血等病理变化较对照组更明显（图2E）。Ma sso n染色结果显示:高腺瞟吟饲料喂养组出 现蓝色沉积；与对照组肾脏组织比较，高腺瞟吟喂养 组小鼠肾脏中胶原沉积显著增加，且Sigirr-7小鼠 肾组织的胶原沉积较Sig诂+/+小鼠更严重（图2E）。2.3 Sig肝基因缺失对IL-lp活化MyD88/NF-icBA 3周 20周麻醉后处死G 鼠尾基因组鉴定 收集血清和肾脏Sigirr*4 只-*-,-*-&前/-4只 箱喂食正常饲料3周 20周麻醉后处死鼠尾基因组鉴定 收集血遺和肾脏Sigirr+/+4_c：:;_Sigi/4只 川喂食高腺嗥吟饲料C壬辦*300200100*壬0WT-RIF600400200WT Sigirr WT-RIF S毎/RIF0图2 CKD并发RIF小鼠模型建立WT：S泗存+/+组小鼠;WT-RIF：Sr r+/+小鼠的CKD-RIF模型组;Sigirr亠 组:SZ餉7基因敲除小鼠；Sig ir r-RIF组：Sigirr八小鼠的 CKD-RIF模型组