1、雷 霞等骨碎补总黄酮对去势小鼠海马神经元细胞的抗凋亡作用 第 1 期 29 doi:10.3969/j.issn.2096-5516.2023.01.005论著骨碎补总黄酮对去势小鼠海马神经元细胞的抗凋亡作用雷霞1,2，苏婷1，于浩1，崔悦1，张宁3，王丽红11.佳木斯大学 药学院，黑龙江佳木斯154007；2.无锡市中医医院，江苏无锡214071；3.黑龙江中医药大学，黑龙江，哈尔滨150040中图分类号R741.02 文献标识码A 文章编号2096-5516（2023）01-0029-06 摘要 目的：研究骨碎补总黄酮（Drynaria fortunei，DF）对卵巢摘除所致认知功能障碍小
2、鼠海马神经元的保护作用。方法：本研究将 90 只昆明小鼠随机平均分为空白组、模型组、假手术组（SHAM 组）、雌二醇阳性药（E2）组、DF 组、DF+ICI182780（阻断剂）组，每组 15 只。采用新物体识别实验检测小鼠的记忆能力；应用 HE 染色、透射电镜观察小鼠海马区的细胞形态；通过 TUNEL 法测定小鼠的神经元细胞凋亡比。结果：与空白组相比较，模型组小鼠的识别指数明显下降，海马区神经元细胞数量降低，神经元细胞凋亡比明显增大；与模型组相比较，SHAM 组、E2组及 DF 组小鼠的识别指数均上升，但后者在统计学中具有更为显著的意义，且 SHAM 组、E2组和 DF 组小鼠神经元细胞数量
3、较多、细胞结构清晰可见，神经元细胞凋亡比明显降低；与 DF 组相比较，DF+ICI182780 组细胞凋亡比明显升高，神经元细胞数量明显下降。结论：DF 可以改善去势雌性小鼠的认知功能障碍，抑制海马神经元细胞凋亡，这可能是通过介导雌激素受体（Estrogen receptor，ER）实现的。关键词 认知功能障碍；卵巢摘除；骨碎补总黄酮；凋亡Anti-apoptotic effect of total flavonoids of Rhizoma Drynariae on hippocampal neurons of castrated miceXia LEI1,2,Ting SU1,Hao YU
4、1,Yue CUI1,Ning ZHANG3,Lihong WANG11.School of Pharmacy,Jiamusi University,Jiamusi 154007,China;2.Traditional Chinese Medicine Hospital of Wuxi,Wuxi 214071,China;3.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,ChinaAbstractObjective:To study the protective effect of total flavonoids of R
5、hizoma Drynariae(Drynaria fortunei，DF)on hippocampal neurons in mice with cognitive dysfunction induced by ovariectomy.Methods:The 90 Kunming mice were randomly divided into control group,model group,sham surgery group(SHAM group),estradiol-positive drug(E2)group,DF group,or DF+ICI182780(blocker)gro
6、up,and there were 15 mice each group.To know the memory ability of experimental mice in this study,new object recognition experiment was employed.Morphology of mouse hippocampal zone was visualized by HE staining or using transmission electron microscopy.The neuronal apoptosis ratio of mice was dete
7、rmined through TUNEL.Results:Compared to control group,the recognition performance was significantly downregulated,the neuronal cells in the hippocampus were decreased,and the neuronal apoptosis ratio was significantly increased in the model group;Compared to Model group,the recognition performances
8、 in SHAM group,E2 group or DF group were upregulated.However only the latter was with significance in statistics.There were more neuronal cells in SHAM group,E2 group and DF group than those in Model group.Also,the cellular structure was clearly visible,and the apoptotic ratio of neuronal cells was
9、significantly decreased in the same groups.Compared to DF group,the apoptotic ratio in DF+ICI182780 group was significantly increased while the neuronal cells were significantly downregulated.Conclusion:DF could improve cognitive dysfunction and inhibit the apoptosis of hippocampal neurons in castra
10、ted female mice,which may work through ER.Key wordsCognitive dysfunction;Ovariectomy;Total flavonoids of Rhizoma Drynariae;Apoptosis基金项目：黑龙江省中医药科研项目（ZHY202088）；黑龙江省自然科学基金项目（LH2020H097）；黑龙江省卫生健康委科研项目（2020-302）；无锡市卫健委科研项目（M202206）第一作者：雷 霞，Email：通讯作者：王丽红，E-mail：wlh_阿尔茨海默病及相关病杂志 2023 年第 6 卷 30 流行病学数据显示，
11、女性在绝经后患认知功能障碍的可能性约为男性的两倍。女性卵巢功能在绝经后会出现减退，同时，其雌激素水平也会随之下降，伴随雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）敏感性发生下降，海马神经元细胞缺乏雌激素的保护作用后会出现凋亡、炎症等病理改变，导致认知功能障碍的风险增加1。大量研究表明，雌激素替代疗法能够减轻绝经期女性雌激素下降甚至减退的症状，但长期服用雌激素可能会增加乳腺癌、子宫内膜癌等风险2。因此，寻找一种安全有效的雌激素替代物迫在眉睫，其中温和的植物雌激素成为研究热点。研究表明，植物雌激素不仅能够调控神经细胞的表达，更对认知功能障碍、记忆力减退等症状有明显的改善作用3。越来越多报
12、道，黄酮类雌激素可以通过与ER相互作用发挥雌激素活性4。骨碎补Drynaria fortunei(Kunze)J.Sm.是一味含有多种黄酮类化合物的中药，课题组前期研究发现骨碎补总黄酮（Drynaria fortunei，DF）能够通过植物雌激素活性对神经元细胞起到保护作用5-7。由此，我们推测 DF 可以通过 ER介导发挥对雌激素缺乏型小鼠海马神经元细胞的抗凋亡作用。1实验材料1.1动物SPF 级 雌 性 昆 明 小 鼠 90 只，6 周 龄，体 质 量302 g，本研究中所有动物实验操作流程均通过黑龙江中医药大学实验动物伦理委员会批准，实验动物由黑龙江中医药大学 GLP 实验中心提供，合格
13、证号：SCXK（黑）2019-0001。1.2药物和主要试剂雌 二 醇（纯 度 98%，S30633），购 于 源 叶 生物；骨碎补总黄酮（总黄酮含量为 98%，国药准字Z20133051），购于北京岐黄制药有限公司；ER 阻断剂（ICI182780），购于 TOCRIS 公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（C1091），购于碧云天生物技术有限公司。1.3主要仪器设备新物体识别（型号：RD-1121-NR-M，上海移数信息科技有限公司）；光学显微镜（型号：BX41，奥林巴斯）；透射电镜（型号：HT7700，日立）。2实验方法2.1动物造模、分组及给药90 只雌性小鼠按体重随机分为 6 组，即
14、空白组、模型组、假手术组（SHAM 组）、雌二醇阳性药组（E2组）、DF 组、DF+ICI182780 组，每组 15 只。采用小鼠双侧卵巢摘除模拟女性绝经后体内雌激素水平骤降，诱导小鼠出现认知功能障碍，做为模型组。利用呼吸麻醉机对除空白组小鼠外其余各组小鼠进行异氟烷麻醉，将其腹位固定，在背部中线下 1/3 处两侧剪一切口，并切开皮肤和背肌 0.5 cm，找出卵巢，SHAM 组小鼠只切除卵巢附近脂肪团，其余 4 组结扎子宫角，切除卵巢并剪去余线，将子宫角按原位送回，缝合切口，最终其余 4 组得到双侧卵巢摘除模型。手术完成 7 d 后，空白组、模型组及 SHAM 组小 鼠 分 别 灌 胃 蒸 馏
15、 水；E2组、DF 组 分 别 灌 胃 E2（27.273 mg/Kgd-1）及 DF（132.955 mg/Kgd-1）；DF+ICI182780 组需提前 30 min 腹腔注射 ICI182780（0.098 mg/Kgd-1），ICI182780 注射完成后再灌胃DF（132.955 mg/Kgd-1），连续给药 21 天。第 22 天进行新物体识别实验。2.2新物体识别实验实验分为熟悉期、训练期和测试期三个部分。实验过程按王馨晨方法进行操作8，并分别记录小鼠 5 min 内对新旧物体接触时间（Tn，Tf），最后通过公式 识别指数=（Tn-Tf）/（Tn+Tf）计算出小鼠对新事物和熟悉
16、事物的记忆能力（识别指数高代表小鼠记忆能力强，反之，则代表小鼠记忆能力弱）。2.3病理组织学观察2.3.1HE 染色观察小鼠的海马区病理学变化新物体识别实验后，小鼠禁食不禁水，并应用异氟烷对其进行麻醉，每组于冰上各取 5 只小鼠全脑并用刀片沿中线分为两半，4%多聚甲醛固定液进行固定 24 h，之后进行脱水、包埋、切片（厚度 4 m）、脱蜡水化、HE染色，最后中性树胶封片，显微镜下观察，并通过 Image J 软件对 400 倍图片中各组小鼠海马神经元细胞数量进行计数。2.3.2透射电镜观察小鼠海马超微结构变化按“2.3.1”所述方法取小鼠半脑并切成约1 m大小，用 2.5%戊二醛及 1%锇酸分别固定 2 h、1.5 h 后进行脱水、包埋、切片，按仲丽丽等操作步骤进行观察9。2.3.3TUNEL 法测定细胞凋亡比小鼠半脑处理方法按“2.3.1”所述进行操作，经脱水、包埋、切片后，根据 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒进行染色操作，并根据凋亡细胞个数/细胞总数的公式来计算各组神经元细胞的凋亡比（阳性凋亡细雷 霞等骨碎补总黄酮对去势小鼠海马神经元细胞的抗凋亡作用 第 1 期 31 胞为棕色）。