1、1 9 7CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESIS论著癌变畸变突变2023 年 5 月第 35 卷第 3 期收稿日期：2023-03-22；修订日期：2023-04-20作者信息：王 平，E-mail：wangping_。*通信作者，雷大军，E-mail：骨肉瘤患者血清外泌体中miR-193a和miR-21-5p表达水平及其临床意义王平1，王华勇2，王浩2，雷大军1，*(1枣阳市第一人民医院康复医学科，湖北枣阳441200；2枣阳市第一人民医院骨科，湖北枣阳441200)Expression of miR-193a andmiR-21-5p in ser
2、um exosomesfrom osteosarcoma patientsand their clinical valuesWANG Ping1,WANG Huayong2,WANG Hao2,LEI Dajun1,*(1.Department of Rehabilitation Medicine,Zaoyang First Peoples Hospital,Zaoyang 441200;2.Department of Orthopedics,Zaoyang First PeoplesHospital,Zaoyang 441200,Hubei,China)【摘要】目的：探讨血清外泌体中miR-
3、193a和miR-21-5p在骨肉瘤患者中的表达水平及其与骨肉瘤临床病理指标的关系和对预后的影响。方法：收集2016年1月2021年12月于枣阳市第一人民医院就诊的112例骨肉瘤患者临床资料，另取100例健康体检者为对照组。采集受试者外周血 5 mL，制备血清并分离提纯血清外泌体，采用实时荧光定量 PCR(qPCR)检测 miR-193a 和miR-21-5p的表达水平。利用受试者工作特征曲线(ROC)评估miR-193a和miR-21-5p在骨肉瘤组和健康对照组患者血清中的表达差异，并分析其与临床病理指标和预后的相关性。结果：与健康对照组相比，骨肉瘤患者血清外泌体miR-193a和miR-2
4、1-5p表达水平均显著升高(P0.01)。miR-193a和miR-21-5p对骨肉瘤诊断效能的曲线下面积(AUC)分别为0.811和0.880，灵敏度分别为89.2%和90.2%，特异度分别为75.0%和84.0%。二者联合诊断的AUC为0.901，高于单一指标的诊断效能，灵敏度为92.1%，特异度为86.5%。骨肉瘤患者血清外泌体miR-193a和miR-21-5p表达升高与TNM分期、远处转移和更差的预后相关(均P0.05)。结论：miR-193a 和 miR-21-5p 表达水平在骨肉瘤患者血清外泌体中显著升高，且提示更差的预后。血清外泌体 miR-193a 和miR-21-5p有望成
5、为骨肉瘤诊断和预后预测的生物标志物。【关键词】外泌体；miR-193a；miR-21-5p；骨肉瘤；诊断；预后中图分类号：R738.1文献标志码：A文章编号：1004-616X(2023)03-0197-05doi：10.3969/j.issn.1004-616x.2023.03.007【ABSTRACT】OBJECTIVE：To observe expression levels of serum exocrine miR-193a and miR-21-5p inpatients with osteosarcoma，and to explore their diagnostic and p
6、rognostic values.METHODS：A total of 112osteosarcoma patients who visited our hospital from January 2016 to December 2021 were collected as thestudy subjects，and 100 healthy people as the controls.From all individuals，5mL peripheral blood werecollected from each，and serum samples were isolated for ex
7、osomes collection.Expression levels of miR-193aand miR-21-5p were detected by real-time quantitative PCR(qPCR).ROC curves were used to evaluatediagnostic values of miR-193a and miR-21-5p for osteosarcoma，and to analyze their correlation with clinicalfeaturesandprognosis.RESULTS：ExpressionlevelsofmiR
8、-193aandmiR-21-5pfrompatientsweresignificantly higher than those from controls(P0.05).The osteosarcoma diagnosis AUC of miR-193a andmiR-21-5pwere0.811and0.880，respectively.Theirsensitivitieswere89.2%and90.2%，andthespecificities were 75.0%and 84.0%，respectively.The osteosarcoma diagnosis AUC of the c
9、ombined methodwas 0.901，which was higher than that of the single index.The sensitivity and specificity were 92.1%and86.5%，respectively.Osteosarcoma patients with high expression levels of miR-193a and miR-21-5p were oftenassociatedwithadvancedTNMstages，riskofdistantorganmetastasisandworseprognosis(P
10、0.05).CONCLUSION：TheexpressionlevelsofmiR-193aandmiR-21-5pintheserumexosomesfromosteosarcoma patients were significantly increased.The increase was associated with advanced TNM stages，论著癌变畸变突变1 9 8CARCINOGENESIS，TERATOGENESIS&MUTAGENESISVol.35No.3May 2023higherriskofdistantorganmetastasisandworsepro
11、gnosis.Thus，serumsecretionsofmiR-193aandmiR-21-5p can be considered as biomarkers for diagnosis and prognosis of osteosarcoma.【KEY WORDS】exosome；miR-193a；miR-21-5p；osteosarcoma；diagnosis；prognosis骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，其发病高峰与青少年的青春期生长高峰相一致1。骨肉瘤通常发生在长骨干骺端的生长板附近，约三分之二的骨肉瘤发生在股骨远端的膝关节周围，其次是胫骨近端，再次为肱骨近端。尽管临床治疗
12、手段不断发展，但复发转移患者的5年生存率仍不足20%2。骨肉瘤早期症状隐匿，临床亟须高效灵敏的标志物，以实现骨肉瘤早期诊断和预后风险判断。外泌体是一种大小 30100 nm 的微小脂质囊泡，其内包裹有核酸(包括miRNA)、蛋白质和脂类等，可通过胞吐作用进入细胞微环境，调控多种生物过程3。外泌体miRNA参与肿瘤微环境重建，在骨肉瘤的侵袭转移和发生发展中具有重要调节作用4-5。外泌体miRNA广泛存在于血液、尿液等体液中，可通过非侵入性操作获取，是骨肉瘤诊断和预后预测的重要方法。研究显示，miR-193a和miR-21-5p在促进骨肉瘤增殖转移和化疗耐药中发挥重要作用6-8。本研究通过对112
13、例骨肉瘤患者和100例健康体检者血清外泌体miR-193a和miR-21-5p表达水平进行检测，拟探讨血清外泌体 miR-193a 和miR-21-5p在骨肉瘤诊断和预后预测中的临床意义。1材料与方法1.1一般资料选取2016年1月2021年12月于枣阳市第一人民医院骨科就诊的骨肉瘤患者112例为骨肉瘤组。纳入标准：病理确诊为骨肉瘤；抽血检查前未接受手术或者放化疗；无合并其他系统疾病；临床病例资料完整。排除标准：合并代谢性骨病或其他骨组织疾病；伴有其他器官功能障碍；病例失访。同期选取该院体检中心，100例年龄性别匹配的健康体检者作为健康组，对两组人群进行血清外泌体检测，并收集骨肉瘤组患者的年龄
14、、性别、肿瘤直径和TNM分期等临床资料。本研究112例骨肉瘤患者中18周岁以下患者78例，发病部位为股骨远端患者68例，肿瘤直径8 cm9的患者 84 例，病理类型为普通型 78例，组织学分类为G1级别者82例。本研究经枣阳市第一人民医院伦理委员会审批同意(批准文号为20170312)。1.2血清外泌体分离与鉴定取受试者外周血5 mL，分离血清。利用外泌体提取试剂盒(广州锐博生物公司)进行外泌体提取，将富集纯化后的外泌体4 保存。将分离提纯的血清外泌体进行醋酸双氧铀水染色，利用透射电镜观察外泌体形态，并进一步利用Western blot检测外泌体特异性标志蛋白CD9和CD63的表达，保证分离提
15、纯外泌体的可靠性。CD9和CD63的抗体，均购自英国Abcam公司。Western blot具体操作步骤：使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离提纯的外泌体蛋白质；将分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；进行一抗 CD9(11 000)和 CD63(11 500)抗体孵育，内参对照蛋白为GAPDH；进行二抗孵育；目标蛋白条带发光显示。1.3血清外泌体中miRNA提取与qPCR检测外 泌 体 miRNA 提 取 试 剂 盒(DP501)购 自 德 国Qiagen公司，按照试剂盒说明书进行外泌体miRNA提取，利用反转录cDNA试剂盒(RR037Q，日本TaKaRa
16、公 司)将 总 miRNA 反 转 录 为 cDNA，并 使 用 SYBRGreen Mix(日本TaKaRa)和C1000系统(美国Bio-Rad)进行 实 时 荧 光 定 量 PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)检测。选择 50 L 扩增体系(上下游引物各 2L，DNA聚合酶2.5 U，10缓冲液和dNTPs 4 L，ddH2O补齐至50 L)，每个样本重复检测3次，结果取平均值。用U6作为miRNA定量检测的内参10，采用2-CT计算 miR-193a 和 miR-21-5p 的相对表达量。miR-193a、miR-21-5p和U6的引物序列设计、合成由擎科公司完成，序列(5-3)如下：miR-193a，F-TTCAACAACGTCCACCAA，R-CCAGACTCCGGTGTAGAC；miR-21-5p，F-AACTGCAGGCACTCGTTC，R-TGCTGGAAGAGGTCGGTA；U6，F-AGCATTACTAAAATTGAACAT，R-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT。1.4统计学分析应用 SPSS 26.0 进行统计分析，采