1、第44 卷第 6 期 2023 年 6 月安徽医学Anhui Medical Journal负载双氢青蒿素的中空介孔二氧化锰纳米颗粒对胰腺癌 BxPC-3 细胞的杀伤效应刘刚 刘明宇 李修靖 余跃摘 要 目的探究负载双氢青蒿素（DHA）的中空介孔二氧化锰纳米颗粒对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤效应。方法利用二氧化硅模板法合成了纳米中空介孔二氧化锰，通过DHA及聚乙二醇-2000（PEG-2000）共孵育后合成了PEGMnO2-DHA和未载药的PEGMnO2，并对其进行表征和催化性能验证。利用激光共聚焦显微镜（CLSM）分别检测0、1、2和4 h内BxPC-3细胞对纳米颗粒的摄取情况。采用酶联免疫
2、吸附试验（ELISA）检测不同氧浓度下经PEGMnO2-DHA处理后BxPC-3细胞内的缺氧诱导因子-1（HIF-1）水平，以探究PEGMnO2-DHA改善肿瘤微环境乏氧情况。最后用噻唑蓝比色法（MTT）和活死细胞染色法观察纳米颗粒对BxPC-3细胞的生长抑制作用。结果本研究成功制备出粒径约为105 nm的PEGMnO2-DHA，并且其能够在RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清）中稳定保存。CLSM结果显示，PEGMnO2-DHA在1h后就能够被BxPC-3细胞有效摄取。ELISA结果显示，低氧条件下，使用20 g/mL的PEGMnO2-DHA处理后的BxPC-3细胞内HIF-1水平与使
3、用磷酸缓冲盐溶液（PBS）处理后的BxPC-3细胞内HIF-1水平相比明显下降（P0.05），略低于常氧条件下PBS处理后的BxPC-3细胞中HIF-1水平（P=0.846）。MTT结果显示，在DHA浓度为15 g/mL时，PEGMnO2-DHA处理组细胞存活率仅为21.81%，低于游离DHA处理组的46.03%（P0.05）。结论负载DHA之后的中空介孔二氧化锰纳米颗粒可以被BxPC-3细胞有效摄取，并与释放出来的DHA反应产生活性氧，同时能改善肿瘤微环境乏氧情况，增强对胰腺癌细胞的杀伤效应。关键词 双氢青蒿素；中空介孔二氧化锰；活性氧；胰腺癌doi:10.3969/j.issn.1000-
4、0399.2023.06.001Killing effect of hollow mesoporous MnO2 nanoparticles loaded with dihydroartemisinin on pancreatic cancer BxPC-3 cell lineLIU Gang1，LIU Mingyu1，LI Xiujing1，YU Yue21.Division of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine,Hefei 230031,China2
5、.Division of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of USTC,Division of Life Science and Medicine,University of Science and Technology of China,Hefei 230001,ChinaFunding project:The General Program of National Natural Science Foundation of China（No.31870993）Corresponding author:YU Yue，Abstra
6、ct ObjectiveTo investigate the killing effect of hollow mesoporous MnO2nanoparticlesloaded withdihydroartemisinin(DHA)on pancreatic cancer BxPC-3 cells.Methods Hollow mesoporous MnO2 nanoparticles were synthesized by SiO2template method.PEGMnO2-DHA and PEGMnO2 were synthesized by co-incubation with
7、DHA and Polyethylene glycol 2000(PEG-2000),then characteristics and catalytic properties were investigated.The uptake of nanoparticles by BxPC-3 cells at different time(0,1,2 and 4 h)was detected by laser confocal microscopy(CLSM).The level of HIF-1 in BxPC-3 cells was detected by ELISA assay to inv
8、estigate the effect of PEGMnO2-DHA on hypoxia in tumour microenvironment(TME).Lastly,the growth inhibition of BxPC-3 cells by nanoparticles was observed by MTT assay and cell death staining.ResultsPEGMnO2-DHA with a particle size of about 105 nm was successfully prepared and could be stably stored i
9、n RPMI-1640 medium containing 10%fetal bovine serum.CLSM results showed that PEGMnO2-DHA could be efficiently taken up by BxPC-3 cells.ELISA results showed that HIF-1 levels in BxPC-3 cells cultured under hypoxic conditions were significantly reduced after treatment with PEGMnO2-DHA at 20 g/mL compa
10、red with PBS treatment(P0.05),and the HIF-1 level in BxPC-3 cells was slightly lower than that in the normoxia group after PBS treatment（P=0.846).MTT results showed that the cell survival rate of the PEGMnO2-DHA 基础医学 基金项目：国家自然科学基金面上项目(编号：31870993）作者单位：230031 安徽合肥 安徽中医药大学第一附属医院脾胃科（刘刚，刘铭宇，李修靖）230001 安
11、徽合肥 中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）消化科（余跃）通信作者：余跃，本文引用格式：刘刚，刘明宇，李修靖，等.负载双氢青蒿素的中空介孔二氧化锰纳米颗粒对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤效应 J.安徽医学，2023，44（6）：623-628.DOI：10.3969/j.issn.1000-0399.2023.06.001623刘刚等：负载双氢青蒿素的中空介孔二氧化锰纳米颗粒对胰腺癌BxPC-3细胞的杀伤效应第 44 卷第 6 期2023 年 6 月 treated group was only 21.81%at 15 g/mL DHA concentration,which was l
12、ower than46.03%of the free DHA treated group(P0.05).ConclusionsThe hollow mesoporous MnO2 nanoparticles loaded with DHA can be effectively taken up by BxPC-3 cellsand react with the released DHA to produce reactive oxygen species,which can also improve the lack of oxygen in the tumor microenvironmen
13、t and enhance the killing effect on pancreatic cancer cells.Key words Dihydroartemisinin；Hollow mesoporous MnO2；Reactive oxygen species；Pancreatic cancer胰腺癌是消化系统常见肿瘤之一，恶性程度极高，5 年生存率低1。近年来，中药因其广谱抗炎和抗癌活性逐渐吸引了学者们的关注。双氢青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是中药青蒿提取物青蒿素经过硼氢化钠还原得到的半合成衍生物，在青蒿素的几种衍生物中表现出较高的抗癌活性。但是由于其水溶
14、性差，生物利用低，半衰期短，导致其应用被限制2-4。中空介孔纳米结构因其优秀的载药性能，吸引了广泛的注意5。其中，中空介孔二氧化锰纳米递药系统在解决药物水溶性差的同时，能够通过实体瘤的高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention，EPR）在肿瘤部位高效富集6-7。研究8-9发现，Mn2+能与 DHA 反应产生具有细胞毒性的活性氧（reactive oxygen species，ROS），继而增强 DHA 的抗肿瘤作用。本研究旨在构建能够负载 DHA 的中空介孔纳米颗粒，并研究其被胰腺癌细胞摄取和改善肿瘤部位乏氧情况，及对胰腺癌细胞的杀伤效应，为进一
15、步开发新的抗胰腺癌药物提供参考。1材料与方法1.1材料DHA 购买自上海晶纯生化科技股份有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）试剂盒，2，7-二氯荧光素二乙酸酯（2，7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），Hoechst33342 购自上海碧云天生物技术有限公司；RPMI-1640 培养基，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），胰酶消化液，1磷酸缓冲液（phosphate buffered
16、 saline，PBS）购买自上海生工公司；BxPC-3 细胞株购自上海细胞库。1.2方法1.2.1PEGMnO2-DHA 的制备首先利用二氧化硅模板法10合成中空介孔二氧化锰，然后取 200 L 的中空介孔二氧化锰溶液（5 mg/mL）与 100 L 的 DHA 溶液（2 mg/mL）混合，超声 10 min 后，置于气浴震荡器25反应过夜，反应结束后收集沉淀，甲醇洗 3 次除去游离 DHA，最后分散在纯水中，得到负载了 DHA 的中空介孔二氧化锰颗粒（MnO2-DHA）。为了提高 MnO2-DHA 的稳定性及水溶性，使用聚乙二醇-2000（polyethylene glycol-2000，PEG-2000）对 MnO2-DHA 进行表面修饰。取 1 mL MnO2-DHA 水溶液（5 mg/mL）与 1 mL 的 PEG-2000（5 mg/mL），超声 10 min 后 37孵育过夜，收集沉淀，用水洗涤 3 次后得到 PEGMnO2-DHA。1.2.2 PEGMnO2-DHA的 表 征 取 新 制 的PEGMnO2-DHA 溶液用去离子水稀释至适当浓度，分别用透射电子显微镜（tr