1、保鲜与加工Storage and Process2023，23（3）：01-08加工研究秋季红香椿芽冷藏期间花青素含量变化及基因表达分析赵倩1,2，谭国飞2，文林宏2，卢松2，文晓鹏1,*，孟平红2,*（1.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院，山地植物资源保护与保护种质创新教育部重点实验室，贵州贵阳550025；2.贵州农业科学院园艺研究所/贵州省园艺工程技术研究中心，贵州贵阳550006）摘要：以秋季红香椿芽为试材，测定其冷藏期间的花青素和叶绿素含量，同时利用转录组数据对红香椿芽中花青素合成基因进行鉴定，并利用实时荧光定量PCR对红香椿芽花青素合成相关基因的相对表达量进行分析，旨在研究
2、秋季红香椿芽在冷藏期间花青素的变化机理。结果表明：利用转录组共鉴定出 9 个与红香椿芽花青素相关的基因（TsPAL、TsC4H、TsCHS、TsCHI、TsF3H、TsF35H、TsDFR、TsANS和Ts3GT）；秋季红香椿芽叶片花青素和叶绿素含量均高于叶柄，且随着冷藏期的延长，红香椿芽花青素含量下降，叶绿素含量在3 d时均升高；除TsPAL和TsC4H基因外，其他与红香椿芽花青素合成相关基因的相对表达量在冷藏期间整体呈下降趋势；相关性分析显示，叶柄中TsPAL、TsC4H和TsCHS基因的相对表达量与花青素含量呈负相关，其余基因的相对表达量与花青素含量呈正相关。关键词：香椿；花青素；冷藏期
3、；基因表达Anthocyanins Contents Changes and Genes Expressions Analysis ofAutumn Red Toona sinensis Buds during Cold StorageZHAO Qian1,2,TAN Guo-fei2,WEN Lin-hong2,LU Song2,WEN Xiao-peng1,*,MENG Ping-hong2,*（1.Key laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region(Min
4、istry ofEducation),College of Life Sciences/Institute of Agro-Bioengineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Institute of Horticulture,Guizhou Academy of Agricultural Sciences/Horticultural Engineering Technology ResearchCenter of Guizhou,Guiyang 550006,China）Abstract:In this paper,the aut
5、umn red T.sinensis buds were taken as test materials,and the anthocyanins and chlorophylls contents during refrigeration were measured,the anthocyanin synthesis genes were identified using transcriptome data,and the relative expressions of genes related to anthocyanin synthesis were analyzed using r
6、eal-time fluorescence quantitative PCR,aiming to study the change mechanisms of anthocyanins in red T.sinensis buds during refrigeration.The results showed that 9 anthocyanin-related genes(TsPAL,TsC4H,TsCHS,TsCHI,TsF3H,TsF35H,TsDFR,TsANS and Ts3GT)were identified by transcriptome.In autumn,the conte
7、nts of anthocyanins and chlorophylls inleaves were higher than those in petioles.With the extension of cold storage period,the contents of anthocyanins in基金项目：贵州省农业科学院项目（黔农科院支撑 2021 05号、黔农科院种质资源202210号）；“贵州省现代农业产业技术体系建设”蔬菜体系项目（GZCYTX2022-0101）；贵州省科技计划项目（黔科合支撑2022重点019号）；贵阳市科技计划项目（筑科合同20215-1号）作者简介：赵
8、倩（1997），女，汉族，硕士在读，研究方向：蔬菜分子生物学。*通信作者：文晓鹏，博士，教授，主要从事果树生物技术与遗传育种研究工作。孟平红，博士，研究员，主要从事蔬菜育种及分子技术研究工作。保鲜研究2023，23（3）：1-81保鲜与加工Storage and Process联系邮箱：2023年第3期香椿（Toona sinensis Roemor），又名香椿芽，为楝科香椿属多年生落叶乔木，是我国特有的木本蔬菜之一1。香椿在我国有2 000多年的栽培历史，各地均有栽种，以安徽、河南、河北、山东等地种植最多2。香椿芽中含有多种营养物质，同时含有类黄酮类、生物碱类等次级代谢产物3-5，具有抗癌、
9、抗菌和预防糖尿病、高血压、心脑血管疾病等功效6-8。根据香椿初出嫩芽叶片和叶柄的颜色，可将香椿划分为红香椿和绿香椿，其中红香椿最受消费者喜爱9。红香椿芽风味浓郁且口感脆嫩，所含丰富的水溶性花青素使香椿芽呈现紫红色10。花青素的生物合成起始于苯丙氨酸，苯丙氨酸在 苯 丙 氨 酸 解 氨 酶（Phenylalanine ammonia lyase,PAL）、肉 桂 酸 羟 化 酶（Cinnamate-4-hydroxylase,C4H）、查尔酮合成酶（Chalcone synthase,CHS）、查尔酮异构酶（Chalcone isomerase,CHI）和黄烷酮-3-羟化酶（Flavanone
10、3-hydroxylase,F3H）的作用下形成二氢山萘酚、二氢槲皮素和二氢杨梅素，然后在类黄酮3 5 羟化酶（Flavonol 3 5hydroxylase,F3 5 H）、二氢黄酮醇还原酶（Dihydroflavonolreductase,DFR）和花青素合成酶（Anthocyanidin synthase,ANS）的作用下分别形成天竺葵素、矢车菊素和飞燕草素，最后在花青素3-O-半乳糖转移酶（Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase,3GT）的作用下形成花青素苷。花青素作为红香椿芽的重要物质成分，是评价红香椿芽品质优劣的重要指标之一。红香椿芽在出售和贮藏
11、过程中易发生老化，花青素也会发生降解11。香椿芽主要食用季节为春季12，但随着市场对香椿芽需求的增加，很多企业及种植户利用设施方式能够使红香椿芽满足春夏秋三季的供应。前人对香椿芽的研究主要集中在春季，而对秋季香椿芽的研究较少13，且有关秋季红香椿芽花青素的研究还未见系统研究报道。本研究以在我国贵州栽培面积较大的红香椿为材料，于秋季采收后对其进行4 低温冷藏，并从课题组建立的红香椿芽转录组数据库中分析和鉴定出红香椿芽花青素合成相关基因。利用qRT-PCR对红香椿芽花青素合成相关基因的相对表达量进行分析，旨在研究红香椿芽在低温冷藏期间花青素含量变化的机理，为秋季红香椿芽贮藏和出售提供一定的参考依据
12、。1材料与方法1.1材料与设备1.1.1材料与试剂优质红香椿芽：2021年9月中旬采摘于贵州省农业科学院园艺研究所，选择颜色一致、长度均匀（810 cm左右），无机械损伤和病虫害的香椿芽进行试验。RNA提取试剂盒（GX型）：北京华越洋生物科技有限公司；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒：南京诺唯赞生物科技有限公司，该试剂盒中有去除基因组成分；SYBR PremixExTaq 试剂盒：南京诺唯赞生物科技有限公司；甲醇、乙醇、冰醋酸：天津市富宇精细化工有限公司；琼脂糖（CB30005）：加立（深圳）生物科技有限公司。1.1.
13、2仪器与设备Alpha-1860紫外分光光度计：上海谱元仪器有限公司；Nanodrop ND-100 微量分光光度计，Forma88000系列立式超低温冰箱：赛默飞世尔科技有限公司；GD-16Plus冷冻组织研磨仪：深圳市新锐科技发展有限公司；VL-200R高速冷冻离心机：湖南迈克尔实验仪器有限公司；CFX ConnettTMBio-Rad PrimePCR仪：上海伯乐生命医学产品有限公司。1.2方法1.2.1试验方案设计将采摘的红香椿放入4 冰箱进行低温冷藏，分别在采摘当天（0 d）、采后1 d、采后2 d、采后3 d同一时间（早上7：00）取样。将红香椿芽叶片和叶柄分别用锡箔纸包好快速放入
14、液氮中速冻，并保存于-80 冰箱，用于红香椿芽各部位RNA的提取以及花青素和叶绿素含量的测定。中图分类号：S609+.3DOI：10.3969/j.issn.1009-6221.2023.03.001文献标识码：Aleaves were degraded,and the contents of chlorophylls were increased at 3 days.Except for TsPAL and TsC4H genes,the relative expression levels of other anthocyanins genes in red T.sinensis buds
15、 showed an overall downward trendduring cold storage.Correlation analysis showed that the relative expression levels of TsPAL,TsC4H and TsCHS genesin petioles were negatively correlated with anthocyanins contents,while the relative expression levels of the remaininggenes were positively correlated w
16、ith anthocyanins contents.Key words:Toona sinensis;anthocyanins;refrigeration;genes expressions2投稿平台：2023年第3期赵倩，等：秋季红香椿芽冷藏期间花青素含量变化及基因表达分析1.2.2红香椿芽花青素的提取和含量测定参照钟秀来等14的方法进行花青素提取和含量测定。用液氮冷冻研磨仪将不同冷藏期的红香椿芽叶片和叶柄研磨成粉末后，各称取约2 g放入20 mL体积分数为0.1%的甲醇中，并加23滴冰醋酸，于室温暗光下浸提8 h，每个样品设置3次生物学重复。浸提液用0.25 m滤头过滤后，使用紫外分光光度计测定其在530、620、650 nm处的吸光度值。根据公式OD=(OD530-OD620)-0.1(OD650-OD620)，并按照0.1个吸光度为1个花青素单位，计算冷藏期间红香椿芽各部位的花青素含量。1.2.3红香椿芽叶绿素的提取和含量测定参照唐容等15的方法，稍作改进。称取不同冷藏期间红香椿芽叶片（去掉中脉）和叶柄约0.2 g，放入研钵，并加入23 mL 95%乙醇研磨成匀浆，接着加入10