1、 305 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期收稿日期：2022-11-07 *通信作者 基金项目：浙江省公益技术研究计划(分析测试)项目(LGC21C200001)；浙江省市场监督管理局检验监测技术装备项目(ZB2022466)。作者简介：徐潇颖，硕士研究生，工程师，研究方向为食品质量安全控制。徐潇颖，刘 柱，毛思浩，陈晶燕，张文萍，梁晶晶*(浙江省食品药品检验研究院，浙江 杭州 310052)摘要：通过全自动固相萃取(Auto-SPE)-高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)实现了螺旋藻中8种微囊藻毒素(
2、MCs)的同时测定。螺旋藻样品经80%(体积分数)的乙腈-水溶液超声提取，选用C18固相萃取小柱进行全自动在线净化后，采用电喷雾正离子多反应模式监测进行分析。通过外标法定量，8种MCs在250 g/kg范围内线性关系良好(相关系数R2不小于0.99)，检出限均为0.5 g/kg，定量限2.0 g/kg。在阴性螺旋藻样品3个不同浓度的加标实验中，回收率在76.5%99.6%之间，相对标准偏差在1.1%4.7%之间。该方法低成本、重现性好、灵敏度高，适用于螺旋藻中多种MCs的定量测定。关键词：全自动固相萃取(Auto-SPE)；螺旋藻；微囊藻毒素；高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)中
3、图分类号：TS 207.3；O 657.63 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0305-07Simultaneous Determination of Eight Microcystins in Spirulina by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Automatic Solid Phase ExtractionXU Xiaoying,LIU Zhu,MAO Sihao,CHEN Jingyan,ZHANG Wenping,LIANG Jingjing*(
4、Zhejiang Institute for Food and Drug Control,Hangzhou 310052,China)Abstract:Simultaneous determination of eight microcystins(MCs)in Spirulina platensis was achieved by automatic solid phase extraction(auto SPE)-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample wa
5、s ultrasound extracted by 80%(v/v)acetonitrile.The liquid substances were purified by C18 column with automatic solid phase extraction(auto-SPE)and analyzed by ESI-MS/MS in the positive ion scan MRM mode.The external standard method was used for the quantification.The linear ranges for 8 MCs were 25
6、0 g/kg,and the correlation coefficients were not less than 0.99.The limits of detection were 0.5 g/kg.The limits of quantification were 2.0 g/kg.The recoveries of the 8 MCs spiked in blank Spirulina samples ranged from 76.5%to 99.6%with the relative 全自动在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法测定螺旋藻中8种微囊藻毒素DOI:10.13684/ki
7、.spkj.2023.04.039 306 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期0 引言藻类食品是以藻类单细胞植物粉为主要原料加入少量赋形剂或者单纯用藻粉制成。螺旋藻的营养价值极高，富含蛋白质、维生素、氨基酸以及微量元素，被誉为“21世纪最佳的营养品”1。早在19781980年，联合国工业发展组织聘请了国内外专家对螺旋藻进行了系统的安全性毒理学评价，确认人和动物食用螺旋藻无毒副作用。1981年美国食品和药品管理局(FDA)认证其为“最佳蛋白质来源之一”，我国卫生部也批准其为“新资源食品”2。而今，随着人民生活水平的提高
8、，健康知识的丰富，社会对保健食品的需求越来越大，同时对保健食品安全性也提出了更高的要求。目前发现螺旋藻的安全问题除了由于养殖条件不够理想导致的重金属铅、砷、汞含量偏高外，还有养殖过程中使用了已受污染的水源，会导致螺旋藻产品存在微囊藻毒素污染的风险3。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)作为蓝藻的次级代谢产物，由环七肽和特殊的芳香族氨基酸侧链-AD-DA构成，其中环七肽中两个特殊位点结合的不同氨基酸基团使微囊藻毒素具有多种异构体，迄今为止已报道的微囊藻毒素多达100种以上4-7。其中，微囊藻毒素的LR亚型(MC-LR)在2017被世界卫生组织国际癌症研究机构列入2B类致癌物清单。但在自
9、然界中，微囊藻毒素含量低，准确定量分析的难度大，目前研究中，采用液相色谱(HPLC)8-9进行检测时，为了达到仪器灵敏度，需要通过固相萃取(SPE)柱对样品进行大体积的富集10-11。而离线大体积富集的过程会耗费大量的人力和时间，为提高前处理效率，李献刚等12采用三通道自动萃取仪，实现了水样的自动化在线富集；而针对HPLC测定微囊藻毒素仪器灵敏度有限的问题，不少学者选用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)代替HPLC13-16，如王军淋等17利用LC-MS/MS的高灵敏度，直接进样完成了水中12种藻类毒素同时测定，其检出限达到0.030.06 g/L。虽然不富集直接进样能实现水中藻毒素的测定
10、18-23，但对于水产品等一些复杂基质24-29，通过适当的前处理净化样品提取时提出的杂质，降低仪器分析过程中的干扰是必不可少的。本文拟利用全自动在线固相萃取(online SPE)技术结合LC-MS/MS对螺旋藻中痕量微囊藻毒素进行测定。样品中的目标物经过提取后，通过online SPE系统程序进行在线净化富集。该方法相比于传统方法，在前处理操作过程中提高了机械化程度和检测效率，通过仪器进行大体积富集净化保证了较好的精密度，同时降低了检出限，为积累实际样品中微囊藻毒素含量提供了技术保障，为监管部门制定螺旋藻中痕量藻类毒素的风险参考值提供了更为科学的依据。1 材料与方法1.1 材料与试剂Oas
11、is HLB固相萃取小柱(500 mg，6 mL)、Sep-pak C18固相萃取小柱(500 mg，6 mL)：美国Waters公司；水：Milli-Q系统纯化水。微囊藻毒素标准品MC-LY、MC-LW、MC-YR、MC-WR、MC-LA、MC-LF、MC-RR、MC-LR(浓度均为10 g/mL)：北京振翔公司。螺旋藻样品：市售，捣碎均匀后，置于4 以下冰箱中储存备用。1.2 仪器与设备岛津LC-MS/MS 8050：日本SHIMADZU公司；Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司；全自动固相萃取仪Fotector plus：美国Reeko公司；氮气吹干仪：瑞典Biotage公
12、司；涡旋混合器：上海琪特公司。1.3 实验方法1.3.1 提取 称取1.0 g均匀样品(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加入20 mL 80%乙腈-水溶液，涡旋混匀10 min，超声提取10 min，5000 r/min离心5 min，混匀。用滤纸过滤，取滤液于50 mL离心管中，加入30 mL水稀释，待净化。1.3.2 固相萃取柱净化 全自动固相萃取仪富集条standard deviations of 1.1%4.7%.The method has the advantages of low cost,good reproducibility and high sensitiv
13、ity.It is suitable for the quantitative determination of multiple MCs in Spirulina.Key words:auto-SPE;Spirulina;microcystins;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrpmetry(HPLC-MS/MS)307 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期件：采用全自动固相萃取仪设定洗脱程序，分别利用HLB固相萃取柱或C18固相萃取柱
14、按表1进行程序设定。表1 全自动固相萃取仪条件程序编号步骤溶剂洗脱方式流速/(mL/min)体积/mL时间/min1ConditionCH3OHWaste5102.62ConditionH2OWaste8101.83ConditionSampleWaste35017.84Condition 5%CH3OHWaste5102.65Air pushWaste1051.16EluteCH3OHCollect155.47Air pushCollect5102.88End将收集的洗脱液于40 氮吹至近干，准确加入1.0 mL流动相初始比例复溶液溶解残渣，过0.22 m滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析
15、。1.3.3 色谱和质谱条件 色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm2.1 mm，1.7 m)；柱温：35；流速：0.35 mL/min；流动相组成：A-0.1%甲酸水溶液，B-乙腈；梯度洗脱程序：02 min，90%A，26 min，90%A10%A，68 min，10%A，8.110 min，90%A。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)为正离子扫描；毛细管电压：4 kV；加热气流速：10 L/min；干燥气流速：10 L/min；DL管温度：250；雾化气：氮气；碰撞气：氩气；检测方式：多反应监测(MRM)。质谱参数见表2。1.4 标准溶液的配
16、制和标准曲线的绘制混合标准中间溶液：吸取10 mg/L的标准储备液0.5 mL于5 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1 mg/L的混合标准中间溶液，18 冰箱保存。混合标准工作曲线：用空白基质溶液(阴性样品提取液)配制2、5、10、20、50 g/L系列浓度标准工作液，现用现配，并按优化后的条件进行分析。2 结果与分析2.1 色谱条件优化多种微囊藻毒素的同时测定依赖于色谱柱的选择，不同色谱柱对8种MCs的分离效果存在一定差异，实验分别选用Waters Cortects C18(100 mm2.1 mm，2.6 m)、Waters AtlantisT3(100 mm2.1 mm，5.0 m)、Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm2.1 mm，1.7 m)进行考察。其中Waters AtlantisT3柱子对非极性化合物保留效果较好，会延长目标化合物的出峰时间，因此8种微囊藻毒素中MC-WR、MC-LF出现了拖尾现象；Waters Cortects C18柱分离时，因无法完全分离部分结构相似的目标物，导致了MC-YR、MC-RR、MC-LR 3个物