1、免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023 论著 文章编号1000-8861（2023）03-0192-08；DOI10.13431/ki.immunol.j.20230025缺氧调节肺腺癌小鼠MDSCs来源外泌体携带的miRNA及其免疫抑制功能郑玉涛，邵烁鋆，薛林怡，彭辉勇，朱栋炜*摘要 目的 观察正常（21%O2）和缺氧（1%O2）条件下，髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）来源外泌体（exosomes derived from MDSCs,MDSCs-E
2、X）的免疫抑制功能，探究缺氧对MDSCs-EX携带miRNA成分以及免疫抑制能力的影响。方法 构建肺腺癌小鼠移植瘤模型，磁珠分选脾脏中的MDSCs，分别在21%O2和1%O2条件下培养MDSCs，提取上清中的外泌体。通过透射电子显微镜观察形态、流式检测颗粒直径、Western bolt检测特异性蛋白鉴定制备的外泌体。观察正常和缺氧条件下MDSCs-EX对CD3+T细胞增殖的影响。对正常和缺氧条件下MDSCs-EX进行miRNA测序分析，观察2者在miRNA表达上的差异，将差异表达前十位的miRNA作为待筛选miRNA。运用siRNA特异性敲减待筛选miRNA，观察缺氧条件下MDSCs-EX携带
3、的miRNA对其免疫抑制功能的影响。结果 成功分选出肺腺癌小鼠脾脏中的MDSCs，并制备了正常和缺氧条件下的MDSCs-EX。相比正常条件下制备的MDSCs-EX，缺氧条件下MDSCs-EX对于CD3+T细胞增殖的抑制能力更强。敲减缺氧条件下MDSCs-EX中表达明显上调的miR-43-3p和Let-7c-5p，MDSCs-EX抑制CD3+T细胞增殖的能力减弱。结论 相比正常氧含量环境，缺氧条件下制备的MDSCs-EX具有更强的免疫抑制能力，这与缺氧MDSCs-EX中携带更多的miR-43-3p和Let-7c-5p相关。关键词 缺氧；髓源性抑制细胞；外泌体；miRNA中图分类号 R392.9文
4、献标识码 AHypoxiaregulatesmiRNAandimmunosuppressivefunctionofMDSCS-derived exosomesZHENG Yutao1,SHAO Shuojun2,XUE Linyi2,PENG Huiyong3,ZHU Dongwei2,*1.Department of Clinic Laboratory.Dantu District Peoples Hospital,Zhenjiang 212100,China;2.Jiangsu KeyLaboratory of Laboratory Medicine,School of Medicine,
5、Jiangsu University,Zhenjiang 212001,China;3.Departmentof Laboratory Medicine,Affiliated People s Hospital,Jiangsu University,Zhenjiang 212002,China*Corresponding Author:ZHU Dongwei,E-mail:Abstract This study was performed to investigate the effects of hypoxia on miRNA components andimmunosuppressive
6、 ability of myeloid-derived suppressor cells(MDSCs)by comparing the immunosuppressivefunction of exosomes(EX)in the culture supernatant of MDSCs under normal(21%O2)and hypoxia(1%O2)conditions.Firstly,the lung adenocarcinoma mouse model was constructed,and MDSCs were sorted by magneticbeads from sple
7、ens,and then cultured under normal or hypoxia conditions.Exosomes were extracted from thesupernatant,and then identified by transmission electron microscopy,flow particle size analysis and Westernblotting.The effects of MDSCs-EX from normal and hypoxia conditions on the proliferation of CD3+T cells
8、wasobserved.The miRNA sequencing analysis was performed to observe the difference in miRNA expression betweenMDSCS-EX under normal and hypoxia conditions,andthe top 10 miRNA with differential expression wereselectedasscreenedmiRNA.SiRNAspecificknockdown was used to observe the effect of miRNAcarried
9、byMDSCS-EXonitsimmunosuppressivefunction.Compared with MDSCS-EX prepared undernormal condition,MDSCS-EX prepared under hypoxia基金项目：国家自然科学基金（81800698）；江苏省大学生创新创业计划（2022102991215X）作者单位：212100，镇江市丹徒区人民医院 检验科（郑玉涛）；212001 镇江，江苏大学医学院 江苏省临床检验诊断重点实验室（邵烁鋆，薛林怡，朱栋炜）；212002，镇江市第一人民医院（江苏大学附属人民医院）检验科（彭辉勇）*通信作者：朱栋
10、炜，E-mail：192免疫学杂志2023年3月第39卷第3期IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.39No.3 Mar.2023髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressorcells,MDSCs）来源于骨髓，以具有强大的免疫抑制功能为特点，在肺癌以及多种肿瘤环境中能够大量产生，在肿瘤的免疫逃逸中起到重要作用1。外泌体（exosomes,EX）是一种膜性囊泡，由细胞内多胞体通过质膜融合向细胞外分泌而形成，EX携带的物质包括蛋白、脂质和核酸等2。其中EX包裹的miRNA在其发挥生物学功能中起到关键作用，研究表明MDSCs包裹的miRNA在其免疫抑制作用中发挥
11、重要功能3-4。EX往往具有亲代细胞的一些特性，并且MDSCs来源的EX（exosomes derived from MDSCs,MDSCs-EX）也被发现具有免疫抑制功能5。缺氧是肿瘤环境的一个重要特征，相比于正常组织和良性肿瘤，大多数实体恶性肿瘤和癌细胞中表达更高水平的缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor,HIF），表明HIF对肿瘤的生长具有重要作用6。此外，有研究表明缺氧可以诱导外核苷三磷酸二磷酸水解酶2（ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 2,ENTPD2）在癌细胞上的表达，介导胞外5-AMP水平升高，
12、进而阻止MDSCs的分化，最终导致MDSCs的积聚7。尽管缺氧对肿瘤以及MDSCs均产生重要的作用，并且有研究表明缺氧调节MDSCs-EX的免疫抑制能力，然而缺氧对MDSCs-EX中发挥免疫抑制功能的miRNA成分以及水平的影响不得而知。本研究对缺氧MDSCs-EX的免疫抑制功能进行了检测，并对缺氧MDSCs-EX携带的miRNA的作用做了初步探索。1材料与方法1.1实验动物与试剂实验所用C57/BL6雄性小鼠购于南京医科大学实验动物中心，小鼠为68周龄。MDSCs磁珠分选试剂盒购于德国MACS公司；外泌体分选Kit购于美国SBI公司；Tecnail2透射电子显微镜购于荷兰Philips公司；
13、RPMI1640、小牛血清、胎牛血清购于美国Gibco公司；羊抗小鼠HIF-1抗体购于英国Abcam公司；HF-100三相培养箱购于上海力康公司；流式细胞仪购于美国贝克曼库尔特公司；凝胶成像系统购于美国GE公司。1.2肺腺癌移植瘤模型的构建用10%小牛血清的1640培养基在5%CO2培养箱中培养Lewis小鼠肺腺癌细胞，在细胞铺满平皿底部85%左右时，用胰酶消化细胞，按每只小鼠2106个Lewis细胞皮下注射到C57/BL6小鼠右侧背部，构建小鼠结肠癌模型。1.3MDSCs细胞的提取摘取肺腺癌模型小鼠脾脏，将其研磨成单细胞悬液，裂解红细胞后用PBE清洗2次，通过MACS试剂盒，用PBE将停留在
14、分选磁柱上的细胞冲洗下来，从而获得MDSCs细胞。1.4MDSCs的培养用含有10%超速离心胎牛血清的1640培养基在三相培养箱中培养24 h。正常氧含量条件是21%的O2，5%的CO2，74%的N2；缺氧条件分别是 10%的 O2，5%的 CO2，85%的 N2，以及1%的O2，5%的CO2，94%的N2。1.5外泌体的制备使用超速离心机离心去除血清中的EX，配置10%的1640培养液，用培养液培养MDSCs 20 h后，通过ExoQuick-TCTM试剂盒提取培养上清中的EX，PBS溶解EX，在-80 条件下保存。1.6CFSE标记法检测T细胞的增殖使用羊抗小鼠CD3抗体包被96圆底孔板，
15、4 过夜。用MACS磁珠分选正常C57/BL6小鼠脾脏的CD3+T细胞，使用CFSE染料对CD3+T细胞进行染色，然后将细胞按照每孔5105个的数量在96孔板中进行培养，加入羊抗小鼠CD28抗体，3 d后使用流式细胞术检测CD3+T细胞的荧光强度，通过细胞每增殖一代荧光强度衰减一半的原理分析T细胞的增殖情况。1.7Western blotting 检测将 MDSCs 或 MDSCs-EX与RIPA裂解液等体积混合，冰上放置1 h，期间每10 min震荡1次。12 000g、4 离心15 min，收集上清。按体积比4 1将蛋白样本和5SDS-PAGE混匀，100 水浴10 min。14 000g
16、 离心10 min 备用。将制备的样本进行SDS-PAGE电泳、转膜后，BSA封闭1 h，加一抗（羊抗小鼠CD9、CD63、HSP70、inhibited the proliferation of CD3+T cells more strongly.After knockdown of miR-43-3p and Let-7c-5p in MDSCs-EX prepared under hypoxia,the suppressive ability of MDSCs-EX decreased.In conclusion,MDSCS-EX preparedunder hypoxia has stronger immunosuppressive ability compared with normal oxygen content environment,which isassociated with higher expression of miR-43-3p and Let-7c-5p.Key words Hypoxia;Myeloid-derived suppressor cell;