1、I C S6 5 1 5 0B5 2圆亘中华人民共和国国家标准G B T2 7 5 2 0 2 01 12 0 1 1-1 1-2 1 发布暗纹东方纯O b s c u r ep u f f e r2 0 1 2 0 3 0 1 实施宰瞀鹳紫瓣警瓣瞥鐾发布中国国家标准化管理委员会仪1 9前言G B T2 7 5 2 0 2 0 1 1本标准按照G B Ti 1 2 0 0 9 给出的规则起草。本标准由农业部提出。本标准由全国水产标准化技术委员会淡水养殖分技术委员会(S A C T C1 5 6 S C1)归口。本标准起草单位：江苏中洋集团股份有限公司、上海海洋大学。本标准主要起草人：钱晓明、李
2、家乐、赵金良、秦桂祥、卢玉平、郭正龙。1 范围暗纹东方纯G B T2 7 5 2 0-2 0 11本标准给出了暗纹东方纯(T a k i f u g u f a s c i a t u s)的主要形态结构特征、生长与繁殖、生化遗传特性和检测方法。本标准适用于暗纹东方纯的种质检测与鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。G B T1 8 6 5 4 1养殖鱼类种质检验第1 部分：检验规则G B T1 8 6 5 4 2 养殖鱼类种质检验第2 部分：抽样方法G
3、 B T1 8 6 5 4 3 养殖鱼类种质检验第3 部分：性状测定G B T1 8 6 5 4 1 2 养殖鱼类种质检验第1 2 部分：染色体组型分析3 名称与分类3 1学名暗纹东方纯T a k i f u g u f a s c i a t u s(M c C l l a n d，1 8 4 4)。3 2 分类地位纯形目(T e t r a o d o n t i f o r m e s)，纯科(T e t r a o d o n t i d a e)，东方纯属(T a k i f u g u)。4 主耍形态结构特征4 1 外形特征4 1 1 形态体呈亚圆筒形，前端钝圆，向后渐狭小，尾柄略
4、为侧扁。胸鳍宽短，无腹鳍，背鳍后位，与臀鳍相对，同形，尾鳍后缘稍圆形。口小，端位。体棕褐色，体侧下方具淡黄色带，腹面白色。体色和条纹随体长不同而有变异。背部具不明显暗褐色横纹4 条6 条，横纹之间具白色狭纹3 条5 条。胸鳍后上方体侧处具1 圆形黑色大斑，边缘白色。背鳍基部具1 长圆形黑色大斑。胸鳍基底外侧和里侧常各具1 黑斑。胸鳍、背鳍、臀鳍黄棕色，尾鳍后端灰褐色。头部及体背、腹面均被小刺，背刺区与腹刺区在眼后部相连。吻侧、鳃孔后部体侧及尾柄光滑无刺。暗纹东方纯的外形见图1。囤1 睹纹东方钝外彩42 可敬性状42 1 背鲭鲭式D I5 I8。422 臀鳍鳍式：A l3 1 6。423 胸鳍鳍
5、式：P】6 1 8；43 可量性状暗纹东方鲢一I 蜒性状比例值见表1。寰1暗纹东方蛀可量性状比例值*F-#l 奉K k女K 自K44 内部特征441 齿颌与齿愈合，I 一、F 各1 对板状齿。442 脊椎骨脊椎骨数目为：2 l 块2,t 块，5 生长与繁殖51 生长捧K 与体重关系参见附泶A。52 繁殖52 1 性成熟年龄雌鱼性成熟年龄3 龄4 龄雄鱼性成熟q 二龄2 龄3 龄522 产卵特点暗纹东方纯为一次产卵型鱼类。绝对怀卵最l0 1 0：粒50 1 0。粒。长江中下游地区产卵期在4 月上旬至6 月下旬，5 月为盛期。523 卵子特征粘性卵，淡黄色半透明，圆球形，卵径09 1Im m 卵膜
6、厚，有弹睦，具油球-附着在基质上6 遗传学特性6 1 细胞遗传掌特性体细胞染色体数为：2 n=4 4。核型公式：1 0m-6s m-8s t+2 0t。染色体组型见图2n一B可a 4矗-A 一 一一_ +囤2 暗纹东方纯染色体组型62 生化遗传学特性肌组4 1 乳随脱氧临(II)H)_ L I II 畸电淋【晰吣煳s图3 暗纹东方纯肌肉乳酸脱氢酶(L D H)同工酶电泳图谱殛扫描围G B T2 7 5 2 0-2 0 1 17 检测方法7 1 抽样方法按G B T1 8 6 5 4 2 的规定执行。7 2 年龄的鉴定采用脊椎骨年龄鉴定法和鳃盖骨年龄鉴定法。7 2 1 脊椎骨年龄鉴定法7 2 1
7、 1 取材取靠近头部的脊椎骨5 块左右。7 2 1 2 处理与观察处理与观察步骤如下：a)将去肉脊椎骨置于水中煮沸5r a i n；b)剔弃脊椎骨附着的脂肪和杂物；c)3 氢氧化钾(K O H)溶液浸泡4 8h，d)水洗烘干；e)用解剖镜观察锥体中央斜凹面上的轮纹，以此确定鱼的年龄。7 2 2 鳃盖膏年龄鉴定法7 2 2 1 取材取出新鲜鱼体。7 2 2 2 处理与观察处理与观察步骤如下：a)用开水烫1 次2 次；b)洗净、去除附着物；c)浸于甘油中1 0m i n 1 5m i n，然后加热到甘油沸点，骨片即变成乳白色；d)用解剖镜观察白色宽层与暗黑色窄层组成的年轮，以此确定鱼的年龄。7 3
8、 主要形态结构特征测定按G B T1 8 6 5 4 3 的规定执行。7 4 细胞遗传学特性的检测按G B T1 8 6 5 4 1 2 的规定执行。7 5 生化遗传学特性的检测7 5 1 样品的采集与制备取活体暗纹东方纯背部肌肉1g，用0 7 生理盐水清洗，加入3 的辅酶I(N A D)溶液3m L，置4G B T2 7 5 2 0-2 0 1 1匀浆器中匀浆，将匀浆液于4、1 20 0 0r m i n 离心3 0m i n，取上清液，重复以上离心过程至上清液澄清。7 5 2 聚丙烯酰胺凝胶制备将混匀的4 聚丙烯酰胺凝胶配方溶液，立即灌注到凝胶模具中，聚合反应结束后，取出凝胶，放在保湿盒内
9、备用。4 聚丙烯酰胺凝胶配方溶液及其制备见附录B 中的B t7 5 3 电泳分离电极缓冲液为T C 电极缓冲液，配制方法见附录B 中的B 2。预电泳；将预先制备的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却板上，在5 0m A 电流下，电泳3 0r a i n。前电泳：预电泳结束后，用微量加样器在凝胶的点样槽中加入8“L 的样品，在2 5m A 电流下，电泳1 0r a i n。正式电泳：在电压2 7 5V 下连续电泳2h。7 5 4 染色电泳结束后，取出聚丙烯酰胺凝胶，放人预先配好并在3 7 恒温箱中保温的染色液中染色。乳酸脱氢酶(L D H)同工酶的染色液配制见附录B 中的B 3。8 检验规则与结果判定按G B
10、 T1 8 6 5 4 1 的规定执行。G B X2 7 5 2 0-2 0 116附录A(资料性附录)养殖暗纹东方纯体长与体重关系体长与体重关系见式(A 1)：W 一0 0 4 36 L29 5 16(R 2 0 9 4 56)式中：w 鱼体体重，单位为克(g)；L 鱼体体长，单位为厘米(c m)oB 1 聚丙烯酰胺凝胶附录B(规范性附录)乳酸脱氢酶(L D H)同工酶电泳分析溶液制备B 1 1 各种凝胶溶液配方各种凝胶溶液配方见表B 1。表B 1 各种凝胶溶液配方G B T2 7 5 2 0-2 0 1 1溶液名称配制方法三羟甲基氨基甲烷(T r i s)3 0 2 85g，用柠檬酸(c
11、i t r i ca c i d)调至T C 制胶缓冲液p H8 0，蒸馏水定容至1L丙烯酰胺(A r c)9 8g，N，N -亚甲基双丙烯酰胺(B i s)2g，用蒸馏水溶A r c B i s 液解并定容到5 0 0m L2 5 T E M 功四甲基乙二胺(T E M E D)2 5m L，加人7 5m L 蒸馏水1 0 A P S过硫酸胺(A P S)0 1g，溶解于1m L 蒸馏水中B 1 24 聚丙烯酰胺凝胶配方4 聚丙烯酰胺凝胶配方见表B 2。表B 24 聚丙烯酰胺凝胶配方溶液量溶液名称m LT C 制胶缓冲液1 4 7A r c B i s 液1 3 22 5 T E M E D
12、0 31 0 A P S0 6蒸馏水3 7 5B 2 电极缓冲液电极缓冲液配方见表B 3。表B 3 电极缓冲液配方溶液名称配制方法T C 电极缓冲液三羟甲基氨基甲烷(T r i s)4 8 6 5g，用柠檬酸(c i t r i ca c i d)调p H 至8 0，蒸馏水稀释至l oLG B T2 7 5 2 0-2 0”B 3 乳酸脱氢酶(L D I t)同工酶染色液B 3 1 各种溶液配方各种溶液配方见表B 4。表B 4 各种溶液配方溶液名称配制方法三羟甲基氨基甲烷(T r i s)1 8 1 7 1g，用盐酸(H C l)调至p H9 5，蒸馏1 5m o l I T r i s-H
13、C l 染色缓冲液(p H 一9 5)水定容至1L1 0 氯化硝基四氮唑蓝(N B T)氯化硝基四氮唑蓝(N B T)2 5 0m g，加入2 5 0m L 蒸馏水乳酸(L a c t i ca c i d)5 6 3m L，用氢氧化钠(N a O H)调至p H7 0，蒸馏1m o l L 乳酸钠水定容到5 0 0m LB 3 2 乳酸脱氢酶(L D I I)同工酶染色液配方乳酸脱氢酶(L D H)同工酶染色液制备见表B 5。表B 5乳酸脱氢酶(L D H)同工酶的染色液配方溶液名称溶液量1 5m o L LT r i sH C I 染色缓冲液(p H 一9 5)1 5m L1 0 氯化硝基四氨唑蓝(N B T)3 0m L1m o l L 乳酸钠1 0m L蒸馏水(H。O)9 5m L辅酶I(N A D)3 0m g吩嗪甲酯硫酸盐(P M S)1 0 5m g