1、书 书 书犐 犆犛 犃?犌犅犜?犜 犲 犮 犺 狀 犻 犮 犪 犾狊 狆 犲 犮 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犳 狅 狉犿狌 狋 犪 犵 犲 狀 犲 狊 犻 狊犫 狉 犲 犲 犱 犻 狀 犵狅 犳犿 犻 犮 狉 狅 狅 狉 犵 犪 狀 犻 狊犿狊?书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：清华大学、洛阳华清天木生物科技有限公司、中国标准化研究院。本标准主要起草人：张罛、邢新会、李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、马爱进。犌犅犜 微生物诱变育种技术规范范围本标准规定了微生物诱变育种要求和证实方法。本标准适用于细菌、放线菌、酵母和霉菌等微
2、生物的紫外、等离子体和化学诱变育种。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。食品安全国家标准致突变物、致畸物和致癌物的处理方法术语和定义下列术语和定义适用于本文件。菌种狊 狋 狉 犪 犻 狀 狊面向工业、农业、食品、医药等用途，在发酵过程中发挥生理代谢作用的微生物。诱变犿狌 狋 犪 犵 犲 狀 犲 狊 犻 狊通过人为的措施诱导遗传物质产生突变的方法。微生物诱变育种犿狌 狋 犪 犵 犲 狀 犲 狊 犻 狊犫 狉 犲 犲 犱 犻 狀 犵狅 犳犿 犻 犮 狉 狅 狅 狉
3、犵 犪 狀 犻 狊犿狊以人工诱变手段诱发微生物遗传物质发生突变，并从突变群体中筛选出所需要的突变株，进而培育成新品种的育种方法。要求 人员试验人员应熟悉基本微生物操作，在开展相关试验前应充分了解使用微生物、诱变剂存在的风险和安全操作规范，试验过程中做好相应防护。设施与环境具有能开展基本微生物试验的实验室或车间，配备相关水、电、气等基础设施；实验室生物安全等级需满足所诱变微生物的要求。诱变材料 总则诱变材料应遵循以下原则：犌犅犜 ）单个、分散的细胞，宜呈悬浮状态；）细胞核越少越好，最好是单核；）按照菌种类型选择合适的培养条件，保证菌种具有旺盛的活力；）诱变材料制作过程应在超净工作台中进行，所加试
4、剂和溶液应提前进行灭菌或过滤除菌操作。菌悬液将菌种接种至合适的培养基中，培养至对数生长期，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬使菌体浓度调整到 。孢子悬浮液将菌种接种至固体平板或斜面上培养至产生大量孢子；用生理盐水洗脱并离心收集。用生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使其充分分散；过滤除掉菌丝体。最后用生理盐水悬浮得到均匀的孢子悬浮液，并将其浓度调整到 。菌丝悬浮液将菌种接种到合适的培养基中培养至产生大量生长旺盛的菌丝，取一定量菌液并离心收集。用生理盐水洗涤两次，再用适量生理盐水重悬并通过机械振荡使菌丝断裂，过滤除去未断裂的菌丝。最后用生理盐水悬浮得到均匀
5、的菌丝悬浮液，并将其浓度调整到 。原生质体悬浮液将菌种接种到合适的培养基上，培养获得大量新鲜菌丝或孢子，收集菌丝或孢子。用渗透压稳定剂洗涤两次并重悬，向重悬液中加入一定量破壁酶，在最适条件下酶解，定时取样于显微镜下观察原生质体释放情况。酶解完成后过滤除去未酶解的菌丝，离心收集原生质体，用渗透压稳定剂洗涤原生质体三次，并将其浓度调整到 。诱变育种操作 紫外诱变紫外诱变育种操作要求如下：）参数设定：宜选择如下参数，紫外线波长 ，紫外灯功率 ，照射距离 。细菌、原生质体、链霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择 ，酵母、霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择 。对于不同的微生物样品和诱变要求应优化选择合适的参数。）提前
6、 开紫外灯。）诱变材料应置于带无菌搅拌子的玻璃平皿中，边照射边搅拌。）每个样品需设三个重复，取相同的诱变材料作为阴性对照，不照射紫外光。）诱变后所有步骤应在暗室红光灯下操作。）处理完成后的材料和阴性对照应避光冰浴。）诱变后样品材料和阴性对照应进行梯度稀释，吸取合适稀释度的菌液涂布固体平板，避光培养至产生单菌落。）应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。常压室温等离子体诱变常压室温等离子体诱变育种操作要求如下：犌犅犜 ）参数设定：宜选择如下参数，照射功率 ，照射距离，工作气体流量 。细菌、原生质体、链霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择 ，酵母、霉菌孢子悬浮液照射时间宜选择 。）每个样品应设三个
7、重复，取相同的诱变材料作为阴性对照，阴性对照不照射等离子体。）照射结束后，应立即把照射过样品放入准备好的预先加入培养基的无菌离心管中，混合均匀。）处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释，选择稀释度合适的菌液涂布固体平板，培养至产生单菌落。）应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。化学诱变化学诱变要求如下：）化学诱变剂的选择：宜根据诱变材料和诱变要求选择合适的化学诱变剂，常用的化学诱变剂及其配制方法参见附录和附录。）化学诱变剂浓度：不同微生物常用诱变剂浓度及处理时间参见附录。）在诱变材料中分别加入不同浓度梯度的诱变剂工作液，混匀后处理不同时间。如需要应再加入反应终止液终止反应，离心，弃掉
8、上清，用无菌去离子水洗涤诱变处理过的菌体。）每个诱变剂量组或每个处理时间组应设三个重复，阴性对照组不加入化学诱变剂，以加入等量无菌水代替。）处理完成后的材料和阴性对照应做梯度稀释，选择稀释度合适的菌液涂布固体平板，培养至产生单菌落。）应统计诱变和阴性对照平板菌落数，计算诱变致死率。）化学诱变剂使用后应按 的方法进行处理。证实方法诱变结果以致死率表示，致死率按式（）计算：犆犆犆 （）式中：致死率；犆 阴性对照平板菌落数；犆 试验组平板菌落数。犌犅犜 附录犃（资料性附录）化学诱变剂种类、作用机制及常用化学诱变剂化学诱变剂的种类、作用机制及常用化学诱变剂见表。表犃 化学诱变剂种类作用机制常用诱变剂碱
9、基类似物代替中的正常碱基 溴尿嘧啶（）氟尿嘧啶（）氮杂尿嘧啶（）氨基嘌呤（）巯基嘌呤（）氮鸟嘌呤（）烷化剂对分子中碱基的烷基化修饰亚硝基乙基脲亚硝基胍硫酸二乙酯硫酸（磺酸）酯类甲基磺酸甲酯甲基磺酸乙酯移码诱变剂移码突变吖啶橙原黄素氧化类诱变剂碱基氧化损伤亚硝酸（及其盐）金属离子机制尚不清楚锰离子犌犅犜 附录犅（资料性附录）常用化学诱变剂配制方法犅 亚硝基胍（犖犜犌）配制方法如下：磷酸缓冲液：分别配制 的溶液、的溶液，前者取出 ，后者取出 ，两者混合即得 的磷酸缓冲液。亚硝基胍溶液：称取 亚硝基胍，用丙酮溶解，保存。用之前向其中加入 磷酸缓冲液，振荡使其充分溶解，过滤除菌。诱变终止剂：磷酸氢二钠
10、缓冲液。取磷酸二氢钠 ，溶于 无菌水中，过滤除菌。犅 亚硝酸钠（犖犐 犜）配制方法如下：醋酸缓冲液：称取醋酸钠，冰醋酸 于烧杯中，加入少量蒸馏水溶解，移入 容量瓶中定溶，充分混匀过滤除菌，保存备用。亚硝酸钠溶液：取亚销酸钠 ，溶于 无菌水中，过滤除菌。使用时与 的醋酸缓冲液以的体积比混合后使用。诱变终止剂：的 溶液。称取，溶解于蒸馏水中。放置在冰箱中备用，使用时过滤灭菌。与诱变液的体积比为。犅 硫酸二乙酯（犇犈犛）配制方法如下：硫酸二乙酯不溶于水，溶于乙醇或乙醚半衰期短，在 条件下半衰期为，所以需要现用现配。取 溶解于 无水乙醇中，配制成 的储备液，过滤除菌。犅 甲基磺酸乙酯（犈犕犛）配制方法
11、如下：的磷酸缓冲液：称取 与，加蒸馏水定容至 ，过滤，灭菌 或 灭菌 ；准确称取 粉末于 容量瓶中，先加入 的磷酸缓冲液溶解，后定容至，配成 的母液，保藏，临用前过滤除菌。犌犅犜 附录犆（资料性附录）常用化学诱变剂诱变条件及致死率常用化学诱变剂诱变条件及致死率见表。表犆 诱变剂工作浓度诱变菌种诱变时间致死率诱变温度亚硝酸钠（）产小檗碱内生真菌菌丝悬液 绿色木霉孢子悬液 室温茂源链霉菌孢子悬液 粘帚霉菌孢子悬液 白腐真菌孢子悬液 平贝母内生真菌菌丝悬液 室温 蜡状芽孢杆菌菌悬液 亚硝基胍（）茂源链霉菌孢子悬液 蜡状芽孢杆菌菌悬液 枯草芽孢杆菌菌悬液 植物乳杆菌菌悬液 放线菌孢子悬液 硫酸二乙酯（）粗壮脉纹孢菌孢子悬液 绿色木霉孢子悬液 山东链霉菌菌悬液 犌犅犜 表犆（续）诱变剂工作浓度诱变菌种诱变时间致死率诱变温度硫酸二乙酯（）嗜热厌氧菌菌悬液 蜡状芽孢杆菌菌悬液 放线菌孢子悬液 甲基磺酸乙酯（）酿酒酵母 氯化锂 乳酸杆菌菌液 放线菌孢子悬液 犌犅犜