1、ICS65.020.01B04中华人民共和国国家标准农业部2630号公告一7一2017转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米4114及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived products-Qualitative PCR method for inseet resistant and herbicide tolerant maize 4114and its derivates2017-12-25发布2018-06-01实施中华人民共和国农业部发布农业部2630号公告一7一2017转基因植物及其产品成
2、分检测抗虫耐除草剂玉米4114及其衍生品种定性PCR方法1范围本标准规定了转基因抗虫耐除草剂玉米4114转化体特异性普通PCR和实时荧光PCR两种检测方法。本标准适用于转基因抗虫耐除草剂玉米4114及其衍生品种，以及制品中4114转化体成分的定性PCR检测下列文件对于本文件.AK2规范性引用文件ma是必可少的件。凡是不注日期的引用,其最板本（包括所有的修单）适用于卒件GB/T6682分送室用水和武验方N农业部1485号-2010取和纯化农业部186号公-2012因植彩及其产品成玉米内标准基因定性PCR方法农业部203因植及甘检测抽相NY/T673术语和定义农业部1861写矜02界定的以及下列术
3、语和定义适用于本文工3.14114转化体特号性序列event-specifie sequence o114m4114外源插片段3端与米基因组的连接区序列，包括转化载体A部分序列与玉米基因组部分序列。4原理根据抗虫耐除草剂玉米414转化体特异性序列设计特异性引物及探针，对试样进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期的DNA片段或典型扩增曲线，判断样品中是否含有4114转化体成分。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的二级水。5.1琼脂糖。5.210g/L溴化乙锭(EB)溶液：称取1.0g溴化乙锭，溶解于100mL水中，避光保存。警告一溴化乙锭有致癌作用，配制
4、和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废弃物。注：根据需要可选择其他效果相当的核酸染料代替溴化乙锭作为核酸电泳的染色剂。5.310mol/L氢氧化钠(NaOH)溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL.5.4500mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Naz)溶液(pH8.0):称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加入70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液(5.3)直至EDTA-Na2完全溶解，用氢氧化钠溶液(5.3)调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。农业部2630号公告一7一20175.51mol/
5、L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tis-HC)溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.6TE缓冲液(pH8.0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(5.5)和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液(5.4)，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min。5.750TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tis),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液(5.4)，用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000m
6、L。使用时用水稀释成1XTAE。5.8加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上3种溶液，加水定容至100mL,在4下保存。5.9DNA分子量标准：可以清楚区分100bp1000bp的DNA片段。5.10 dNTPs混合溶液：将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。5.11 Taq DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液及25mmol/L氯化镁(MgCl,)溶液。5.12玉米内标准基因zSSIIb基因引物5.12.1普
7、通PCR方法引物2SSIIb-1F:5-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3;zSSIIb-2R:5-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3预期扩增片段大小为151bp:5.12.2实时荧光PCR方法引物/探针zSSIIb-3F:5-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3;2SSIIb-4R:5-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3;zSSIIb-P:5-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-BHQ1-3预期扩增片段大小为88bp。5.134114转化体特异性序列引物5.13.1普通PCR方法引物4114-F:5-GCCTCT
8、TGCTCTTCAGGATGA-3;4114-R:5-CGCAGTGAGAACCGTATATCCA-3预期扩增片段大小为296bp(参见附录A)。5.13.2实时荧光PCR方法引物/探针4114-QF:5-CGCTACTAGACAATTCAG-3;4114-QR:5-GAAGTTCTTATATCTGGCGAT-3;4114-P:5-AGACAACTTAATAACACATTGCGGACG-3预期扩增片段大小为102bp(参见附录A)。注：4114-P为4114转化体的TaqMan探针，其5端标记荧光报告基团（如FAM、HEX等），3端标记对应的淬灭基团（如TAMRA、BHQ1等）.5.14引物溶液：用TE缓冲液(5.6)或水分别将上述引物或探针稀释到10mol/L。5.15石蜡油。5.16DNA提取试剂盒。5.17定性PCR试剂盒。5.18PCR产物回收试剂盒。2