1、ICS65.20CCSB46准标家国国口禾壮民人华中农业农村部公告第627号-2022饲料中环丙氨隆的测定DeterninationofcyronaziIIeillfeeds2022-29发布2023030实施中华人民共和国农业农村部发布农业农村部公告第627号2022一目0-口本文件按照GBT1.12020标准化上作导则第部分:标准化文件的结构利起草规则的规定起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件l农业农村部畜牧兽医局提出本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SACTC76）归口本文件起草单位:河南省兽药饲料监察所本文件主耍起草人:吴宁鹏、张盼盼、韩
2、立、彭丽、李慧素、李华举、韩椭、史秀玲、韩俊伟、孟蕾、杨洁、哀聪、张崇威、陈阳、吴志明。农业农村部公告第627号一2022饲料中环丙氨曝的测定范围本文件规定了饲料中环丙氨嗓的高效液相色谱和液相色滞串联质谱测定方法本文件适朋于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料利添加剂预混合饲料中环丙氨臻的测定限为文件于本仅文3定,外标44.2.8磷酸盐缓冲液;称取磷酸氢二辙l3.72g、磷酸二氢钾6.48g加水930mL溶解,混匀4.29流动相:磷酸盐缓冲液（4.2.8）甲醇（4.2.3）乙腊（42.2）93524.2。0环丙氨糜标准储备溶液（1mgmL）:准称取环丙氨糜标袱品（CAS号:662l5278,含量99
3、）10mg（精确至0.0mg）于10mL容量瓶中,加甲醇（42.3）溶解并定容18以下保存,有效期为8个月。42环丙氨糜标准中间工作溶液（10队gmL）:准确移取环丙氨嗓标准储备溶液（4.2.10）1mL于100mL容量瓶中加甲醇（4.2.3）稀释并定容04保存,有效期为3个月4.22环丙氨糜标准工作溶液:准确移取适量标准中间工作溶液（4.2.1）于10mL容量瓶中用流动相（4.2.9）稀释配制成浓度分别为0.05队gmL、0.1件gmL、0.5似gmL、.0队gmL、5.0队gmL、农业农村部公告第627号20220.0队gmL的标准系列溶液临用现配。423混合型阳离子交换固相苯取柱:60m
4、g3mL或性能相当者424微孔滤膜:0.45似m有机系43仪器设备q.3.高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器。432电子天平:感量0.1mg利0.01mg。433涡旋混合器434涡旋振荡器4.3.5离心机:转速不低于10000rmin43.6固相革取装置.37氮吹仪4.4样品按GBT20195的规定制备试样,至少200g,粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛,充分混匀装人密闭容器中备用4.5试验步骤q.5提取平行做2份试验称取试样2g（精确至0.0001g）于50mL离心管中,准确加人提取液（4.2.5）10mL涡旋混匀,振荡提取10mln,于10000rmin离心10mi
5、n,移取上清液至另一50mL离心管。残渣用提取液10mL重复提取1次合并2次上清液混匀,备用4.5.2净化混合型阳离子交换固相苯取柱（42.13）依次用甲醇（4,2.3）、水和提取液（4.2.5）各3mL活化准确移取备用液（4.5.1）1mL过柱用水、甲醇（42.3）和0.1molL盐酸溶液（42.6）各3mL依次淋洗,打干用5氨水乙青溶液（4.2.7）5mL洗脱收集洗脱液于40氮吹至干。准确移取流动相（4.2.9）1mL溶解残余物混匀,过微孔滤膜（4.2.14）待测4.5.3测定q.53.液相色谱参考条件色谱柱:亚乙基桥杂化颗粒键合Cl8柱长250mm,内径4.6mm,粒径5似m,或性能相当
6、者柱温:30检测波长:24nm流速:1.0mLmin进样量:20似L。流动相:4.2.945,3.2标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下,分别取标准工作溶液（4.2.12）和试样溶液（4.5.2）上机测定在上述色谱条件下环丙氨臻标准溶液色谱图见附录A4.53.3定性以保留时间定性试样溶液中环丙氨嗓保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中环丙氨臻的保留时间一致,其相对偏差在2.5之内.5.34定呈以环丙氨凑的浓度为横坐标以其色谱峰面积（响应值）为纵坐标,绘制标准线标准曲线的相关系数应不低于0.999试样溶液中环丙氨凑的问应值应在标准曲线测定的线性范围内如超出线性范围,应将试样用流动相稀释（
7、倍）后重新进样分析单点校准时试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内（相差不超过30）2农业农村部公告第627号-202246试验数据处理试样中环丙氨糜的含最以质量分数计。多点校准按公式（1）计算,单点校准按公式（2）计算.。（1）式中:zol试样中环丙氨糜含量的数值,单位为毫克每千克（mgkg）;p从标准线查得的试样溶液中环丙氨糜浓度的数值,单位为微克每毫升（尸gmL）;V提取液总体积的数值,单位为毫升（mL）;（2）.75。55.联质谱仪测定,5.25.252525.252525.25.2.80.1甲酸溶液:取甲酸1mL加水稀释至1000mL52.90,1甲酸乙背溶液:
8、取乙腊（5.2.2）5mL,加0.1甲酸溶液（5.2.8）稀释至00mL5.2.0环丙氨康标准储备溶液（1mgmL）;准确称取环丙氨糜对照品（CAS号;66215278,含量99）10mg（精确至0.01mg）于10mL容量瓶中,用甲醇（5.2.3）溶解并定容l8以下保存,有效期为8个月5.2环丙氨凑标i中间工作溶液（10似gmL）:准确移取环丙氨凑标准储备溶液（5.2.10）1mI于100mL容量瓶中朋甲醇（5.2.3）稀释并定容04保存有效期为3个月5.2.2环丙氨噪标准工作溶液:准确移取适量标准中间工作溶液（5.2.1l）于10mL容量瓶中用0.1甲酸乙）青溶液（5.2.9）稀释,配制成
9、浓度分别为l0ngmL、20ngmL、50ngmL、100ngmL、200ngmI3农业农村部公告第627号-2022利500ngmL的标准系列溶液临用现配5.2.3混合型阳离子交换固相苹取柱:60mg3mL或性能相当者52.4微孔滤膜:0.22严m,有机系53仪器设备53液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源5.3.2电子天平:感量0.1mg和0.01mg53.3涡旋混合器5,3.4涡旋振荡器5.35离心机:转速不低于10000rmin5.3.6固相荤取装置53.7氮吹仪5样品按GBT20195的规定制备试样至少200g,粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛,充分混匀,装人密闭容器中备用
10、选取类型相同均匀致、且在待测物保留时间处仪器响应值小于方法定量限30的饲料样品作为空白样品5.5试验步骤55.提取平行做2份试验称取试样2g（精确至0.000lg）于50mL离心管中准确加人提取液（5.2.5）l0mL,涡旋混匀振荡提取10mm于10000rmin离心10mln移取上清液至另50mL离心管残渣用提取液10mL重复提取1次合并2次上清液混匀备用5.5.2净化混合型阳离子交换固相苹取柱（5.2.13）依次用甲醇（52.3）、水和提取液（5.2.5）各3mL活化准确移取备用液（5.5.1）2mL过柱,用水、甲醇（5.2.3）和0.1molL盐酸溶液（5.2.6）各3mL依次淋洗抽干用
11、5氨水乙腊溶液（5.2.7）5mL洗脱,收集洗脱液于40氮吹至干准确移取0.1甲酸乙腊溶液（52.9）1mL溶解残余物混匀,过微孔滤膜（5.2.14）待测55.3基质匹配标准溶液的制备取5.4空白试样,按5.5.1和5.5.2处理得到氮气吹干的空白基质分别准确移取环丙氨臻工作溶液（5.2.12）各1.0mL溶解残余物配制成浓度分别为10ngmL、20ngmL、50ngmL、100ngmL、200ngmL和500ngmL的基质匹配标准系列溶液待测55.4测定554.液相色谱参考条件色谱柱:硅胶基质双键键合Cl8,柱长150mm,内径3.0mm,粒径2.1队m,或性能相当者;柱温;35;进样量:5
12、严L;流动相A:0.1甲酸溶液（5.2.8）;流动相B:乙腊（5.2.2）梯度洗脱程序见表1表梯度洗脱程序时间】T】n流速mLmln流动相A流动相B00l.03.05。07.0030.3030.3039595l59595日日距日日农业农村部公告第627号-20225.54.2质谱参考条件离子源:电喷雾电离,正离子模式（ESI）;检测方式:多反应监测（MRM）;离子源喷雾电压:3.5kV;喷雾器温度:300C;鞘气:30Arb;辅助气:5Arb;多反应监测（MRM）离子对、射频电压及碰撞能量见表2表2环丙氨秦的多反应监测（MRM）离子对、射频电压及碰撞能量的参考值射频电压V碰撞能量,cV9l8被
13、测物名称临测离子对,之副日日日了了环丙氨臻43定最离子对5.543基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下分别取环丙氨臻基质匹配标准系列溶液（5.5.3）和试样溶液（5.5.2）上机测定环丙氨糜基质匹配标准溶液定量离子色谱图见附录B。5.5.4.4定性在相同试验条件下试样溶液与基质匹配标准系列溶液（5.5.3）中待测物质的保留时间的相对偏差应在2.5之内根掂表2选择的环丙氨糜定性离子对,比较试样图谱中待测物定性离子的相对离子丰度与浓度接近的基质标准溶液中对应的定性离子的相对离子丰度若偏差不超过表3规定的范围则可判定为试样中存在环丙氨凑表3定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差单位为白
14、分号相对阎子丰度最大允许偏差0士505020日l020士305545定量以环丙氨臻的浓度为横坐标、色谱峰面积（响应值）为纵坐标,绘制标准曲线标准曲线的线性相关系数不低于0.99试样溶液与标准溶液中待测物的问应值均应在仪器检测的线性范围内,如超出线性范围,应重新试验或将试样溶液和基质匹配标准溶液用0.1甲酸乙青溶液（5.2.9）作相应稀释（倍）后重新测定单点校准定量时试样溶液中待测物的浓度与基质匹配标准溶液浓度相差不超过3056试验数据处理试样中环丙氨糜的含量以质量分数计多点校准按公式（3）计算;单点校准按公式（4）计算讲剿棚0（:）式中:p由基质匹配标准川线查得的试样溶液中环丙氨糜浓度的数值,
15、单位为纳克每毫升（ngmL）“-A抓渊删0（）式中:As基质匹配标准溶液中环丙氨臻的峰面积;p基质匹配标准溶液中环丙氨嗓浓度的数值,单位为纳克每毫升（ngmL）;平行测定结果用算术平均值表示,结果保留3位有效数字5农业农村部公告第627号-20225.7精密度在重复性条件下,2次独立测试结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的200（）农业农村部公告第627号-2022附录A（资料性）环丙氨秦标准溶液色谱图环丙氨嗓标准溶液色谱图见图A.1AU0.0200.O18O。0160O1400120。0】00.0080。00600040O020.000遣卜氰戳蹿恒懂-p】nm2.003.（）40
16、05。006007.008O090010001100图A.环丙氨秦标准溶液色谱图（.0队gmL）12.O0l3.）14.0015。00OO（l007农业农村部公告第627号2022附录B（资料性）环丙氨秦基质匹配标准溶液定量离子色谱图环丙氨凑基质匹配标准溶液定量离子色谱图见图B.1相对（）0卡度29080706050403020100lPUB儿 l0111l0U293tIn1n1。2780I）8剧曰一栅舶吊蒋悍昌悍中华人民共和倒到家标准饲料中环丙氨秦的测定农业农村部公告第627号-1-2022兴并瓣中到农业出版社出版（北京市朝阳x发子店街18号楼）（l政编码:100125网址:www.ccap。）北京印刷-厂印刷新华书店北京发行所发行各地新华书店经销瓣瓣兴开本880mm1230mm116印张1宁数20千宇2023年2月第1版2023年2月北京第1次印刷书号:161099337定价:32.00元版权专有侵权必究举报电话:（00）599426农业农村部公告第627号-2022