1、ICS65.020.20B05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T1432-2014代替NY/T1432-2007玉米品种鉴定技术规程,SSR标记法Protocol for the identification of maize varieties-SSR marker method2014-03-24发布2014-06-01实施中华人民共和国农业部发布NY/T1432-2014玉米品种鉴定技术规程SSR标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记法进行玉米(Zea mays L.)品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定规则。本标准适
2、用于玉米自交系和单交种的SS指纹数据采集及品种鉴定，其他杂交种类型及群体和开放授粉品种可参考本标准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682中国实验室用水国家标准3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1核心引物core primer品种鉴定中优先选用的一套SSR引物，具有多态性高、重复性好等综合特性。3.2参照品种reference variety具有所用SS位点上不同等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统
3、误差。4原理由于不同玉米品种遗传组成不同，基因组DNA中简单重复序列的重复次数存在差异，这种差异可通过PR扩增及电泳方法进行检测，从而能够区分不同玉米品种。5仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制见附录B。7引物信息核心引物名单及序列见附录C,核心引物等位变异等相关信息参见附录D。8参照品种信息参见附录E。9操作程序9.1样品制备1NY/T1432-2014送验样品可为种子、幼苗、叶片、苞叶、果穗等组织或器官。对玉米自交系和单交种，随机数取至少20个个体组成的混合样品进行分析，或直接对至少5个个体单独进行分析；对于其他杂交种类型，随机数取至少20个个体单独进行分析。9.2DNA提取CTAB提取法：
4、幼苗或叶片200mg300mg,置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨，或取种子充分磨碎，移入2.0mL离心管：每管加入700uL65预热的CTAB提取液后，充分混合，65保温60min,期间多次颠倒混匀：每管加入等体积的三氯甲烷/异戊醇混合液，充分混合后，静置10min;12000g离心15mi后，吸取上清液至一新离心管，再加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，在一20放置30min;4，12000g离心10min,弃上清液；加入70%乙醇，旋转离心管数次，弃去乙醇；将离心管倒立于垫有滤纸的实验台上，室温干燥沉淀6h以上；加入100L超纯水或TE缓冲液，充分溶解后备用。SDS提取法：剥取干种
5、子的胚，放人1.5ml.离心管中，加入100uL氯仿后研磨，加入300LSDA提取液，混匀后于10000g离心2min,吸上清液加入预先装有300l.异丙醇和300LNaC1溶液的1.5mL离心管中，待DNA成团后挑出，经70%乙醇洗涤后加入200LTE缓冲液，待充分溶解后备用。试剂盒提取法：使用经验证适合SS指纹技术的商业试剂盒，按照试剂盒的使用说明操作。注：以上为推荐的DNA提取方法，其他达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。9.3PCR扩增9.3.1引物选择首先选择附录C中前20对引物进行检测，当样品间检测出的差异位点数小于2时，再选用附录C中后20对引物进行检测：必要时，进一步
6、选择特定标记进行检测。9.3.2反应体系各组分的终浓度如下：每种dNTP0.10mmol/L,正向、反向引物各0.24mol/L,Tag DNA聚合酶0.04U/L,1XPCR缓冲液（含Mg22.5mmol/L),DNA溶液2.5ng/uL,其余以超纯水补足至所需体积。如果PC过程中不采用热盖程序，则反应液上加盖15L矿物油，以防止反应过程中水分蒸发。9.3.3反应程序94预变性5min,1个循环；94变性40s,60退火35s,72延伸45s,共35个循环；72延伸10min,4保存。9.4PCR产物检测9.4.1普通变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)9.4.1.1清洗玻璃板将玻璃板反复擦洗
7、干净，双蒸水擦洗2遍，95%乙醇擦洗2遍，干燥。在长板上涂上0.5mL亲和硅烷工作液，带凹槽的短板上涂0.5L剥离硅烷工作液。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。9.4.1.2组装电泳版待玻璃板彻底干燥后组装电泳板，并用水平仪调平。9.4.1.3灌胶在100mL4.5%PAGE胶中加人TEMED和25%过硫酸铵各100L,迅速混匀后灌胶。待胶流动到下部，在上部轻轻的插入梳子，使其聚合至少1h以上。灌胶时应匀速以防止出现气泡。9.4.1.4预电泳在正极槽（下槽）中加入1TBE缓冲液600L,在负极槽（上槽）加入预热至65的1TBE缓冲液600mL,拔出梳子。在90W恒功率下，预电泳l0min20min。9.4.1.5变性在20LPR产物中加入4L6加样缓冲液，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95变性52