1、I C S月 4 46 5.0 2 0.3 0暑昌中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 4 9 2 6.5 0 一1 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1实验动物微生物学检测方法(3 L a b o r a t o r y a n i ma l-Mi c r o b i o l o g i c a l e x a mi n a t i o n me t h o d s2 0 0 1 一 0 8 一 2 9发 布2 0 0 2 一 0 5 一 0 1实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 周GB/T 1 4 9 2 6.5 01 4 9 2 6.5 5
2、-2 0 0 1目录G B/T 1 4 9 2 6.5 0-2 0 0 1 实验动物酶联免疫吸附试验 1G B/T 1 4 9 2 6.5 1-2 0 0 1 实验动物免疫酶试验.5G B/T 1 4 9 2 6.5 2-2 0 0 1 实验动物免疫荧光试验.9G B/T 1 4 9 2 6.5 3-2 0 0 1 实验动物 血凝试验 二 二”二 二 二 .1 2G B/T 1 4 9 2 6.5 4-2 0 0 1 实验动物血凝抑制试验.1 5G B/T 1 4 9 2 6.5 5-2 0 0 1 实验动物免疫酶组织化学法 .1 9GB/T 1 4 9 2 6.5 2-2 0 0 1前言 本
3、标准修订了G B/T 1 4 9 2 6.1 8-1 9 9 4 实验动物淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒检测方法 中的 免疫荧光试验方法，将其作为一个独立标准列出。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:贺争鸣。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准实 验动 物免 疫 荧光试 验G B/T 1 4 9 2 6.5 2-2 0 0 1La b o r a t o r y a n i ma l-I mmu n o f l u o r e s c e n c e a s s a y UF A)范围本标准规定了免疫荧光试验(I F A)所用试剂、器
4、材和操作步骤等。本标准适用于实验动物病毒抗体的检测。原理 含有病毒抗原的细胞(组织培养细胞或动物组织细胞)固定于玻片上，遇相应抗体形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保持其抗原活性，可与相应的第二抗体荧光素结合物结合。荧光素在紫外光或蓝紫光的照射下，可激发出可见的荧光。因此，在荧光显微镜下以荧光的有无和强弱判定结果。主要试 剂与器材3.1试剂3.1.1 抗原片的制备 将病毒接种于敏感细胞上(见表 1)，待细胞出现病变或确知细胞内含有丰富的病毒抗原后，用胰酶消化下细胞，P B S洗涤三次，用适量 P B S悬浮细胞，将细胞悬液滴于玻片孔中。同时消化未感染病毒的同批细胞，滴加同一玻片另一孔内，作
5、为正常细胞对照。孔内滴加的细胞以细胞铺开、不重叠为宜。室温干燥后，冷丙酮(4 C)固定 1 0 mi n e P B S漂洗后，充分干燥，置于一2 0 备用。在一2 0 C 条件下可保存一年。3.1.2 羊或兔抗小鼠、大鼠、地鼠、豚鼠、兔、犬或猴I g G异硫氰酸 荧光素结合物，使用时用含。.0 1%-0.0 2 写伊文思蓝 P B S 稀释至适当浓度。3.1.3 阳性血清 用病毒抗原免疫清洁或 S P F小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或普通级兔、犬、猴所获得的抗血清;或自然感染恢复后的犬、猴血清。3.1.4 阴性血清 清洁或S P F 小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠 血清;或确认无相应病毒感染的兔、犬、猴血
6、清。3.1.5 P B S(0.0 1 m o l/L,p H7.4)氯化钠8 9 氯化钾。.2 9 磷酸二氢钾。.2 9 磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H O)2.8 3 g 蒸馏水加至1 0 0 0 m L3.1.6 5 0%甘油 P B S 甘油5 mL P B S(0.0 1 m o l/L,P H7.4)5 mL中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2 0 0 1 一 0 8-2 9 批准2 0 0 2-0 5-0 1 实施 1 0G B I T 1 4 9 2 6.5 2-2 0 0 13.2器材3.2.1 荧光显微镜。3.2.2 超净工作台。3.2.3 低温冰箱。3.2
7、.4 3 7 C 培养箱。3.2.5 恒温水浴箱。3.2.6 印有 1 0 4 0 个小孔的玻片。3.2.7 微量加样器，容量 5 5 0 k L,4操作步骤4.，取出抗原片，室温干燥后，将适当稀释的待检血清和阴性、阳性血清分别滴于抗原片上，每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，3 7 C 3 0 -4 5 m i n,4.2 P B S洗三次，每次 5 mi n,室温干燥。4.3 取适当稀释的荧光抗体，滴加于抗原片上，置湿盒内，3 7 C 3 0 -4 5 mi n,4.4 P B S洗三次，每次 5 mi n.4.5 5 0%甘油P B S封片，荧光显微镜下观察。5 结果判 定 在阴性、阳性对照血清成立的条件下，即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无荧光;阳性血清与正常细胞反应无荧光，与病毒感染细 胞反应有荧光反应，即可判定结果。5.1 待检血清与正常细胞和病毒感染细胞均无荧光反应，判为阴性。5.2 待检血清与正常细胞反应无荧光，与感染细胞有荧光反应，判为阳性。根据荧光反应的强弱可判定为十一+。表 1 I F A细胞抗原片的 制备