1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.2 52 0 1 6食品安全国家标准食品中杂色曲霉素的测定2 0 1 6-1 2-2 3发布2 0 1 7-0 6-2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B5 0 0 9.2 52 0 1 6 前 言 本标准代替G B/T5 0 0 9.2 52 0 0 3 植物性食品中杂色曲霉素的测定 和S N/T2 4 8 32 0 1 0 进出口粮谷中柄曲霉素含量检测方法 液相色谱法。本标准与G B/T5 0 0 9.2 52 0 0 3相比,主要变化如下:标准名称修改为“食
2、品安全国家标准 食品中杂色曲霉素的测定”;增加了液相色谱-串联质谱法;增加了液相色谱法。G B5 0 0 9.2 52 0 1 61 食品安全国家标准食品中杂色曲霉素的测定1 范围本标准规定了液相色谱-串联质谱法和高效液相色谱法测定杂色曲霉素的测定方法。本标准适用于大米、玉米、小麦、黄豆及花生中杂色曲霉素的测定。第一法 液相色谱-串联质谱法2 原理试样中的杂色曲霉素乙腈-水溶液提取,经涡旋、超声、离心,取上清液经稀释,通过固相萃取柱或免疫亲和柱净化、浓缩、甲醇-水溶液定容、微孔滤膜过滤,液相色谱分离,电喷雾离子源离子化,多反应离子监测检测,同位素内标法定量。3 试剂和材料除非另有说明,本方法使
3、用的试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 乙腈(CH3C N):色谱纯。3.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。3.1.3 氯化钠(N a C l)。3.1.4 磷酸氢二钠(N a2H P O4)。3.1.5 磷酸二氢钾(KH2P O4)。3.1.6 盐酸。3.1.7 氯化钾(K C l)。3.2 试剂配制3.2.1 乙腈-水溶液(8 0+2 0):取8 0 0m L乙腈,加2 0 0m L水,混匀。3.2.2 乙腈-水溶液(4 0+6 0):取4 0 0m L乙腈,加6 0 0m L水,混匀。3.2.3 甲醇-水溶液(4 0+6 0):取4 0 0
4、m L甲醇,加6 0 0m L水,混匀。3.2.4 甲醇-水溶液(7 0+3 0):取7 0 0m L甲醇,加3 0 0m L水,混匀。3.2.5 磷酸盐缓冲溶液(以下简称P B S):称取8.0g氯化钠,1.2g磷酸氢二钠(或2.9 2g十二水磷酸氢二钠),0.2g磷 酸 二 氢 钾,0.2g氯 化 钾,用9 0 0 m L水 溶 解,用 盐 酸 调 节p H至7.4,用 水 定 容至10 0 0m L。G B5 0 0 9.2 52 0 1 62 3.3 标准品3.3.1 杂色曲霉素标准品(C1 8H1 2O6,C A S号:1 0 0 4 8-1 3-2):纯度9 9%,或经国家认证并授
5、予标准物质证书的标准物质。3.3.2 1 3C1 8-杂色曲霉素同位素内标:2 5g/m L,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。3.4 标准溶液配制3.4.1 标准储备溶液(1 0 0g/m L):准确称取杂色曲霉素标准品1.0 0m g(准确至0.0 1m g),用甲醇溶解并定容至1 0m L。溶液转移至试剂瓶中后,密封后-2 0下保存,保存期6个月。3.4.2 标准工作液(1g/m L):准确移取1.0 0m L的杂色曲霉素标准储备溶液至1 0 0m L容量瓶中,用甲醇定容。-2 0下保存,保存期3个月。3.4.3 同位素内标工作液(1.0g/m L):准确移取杂色曲霉素同位素内标
6、(2 5g/m L)0.4 0 m L至1 0m L容量瓶中,用甲醇定容。-2 0下保存,保存期3个月。3.4.4 标准系列工作溶液:准确移取标准工作液适量至5m L容量瓶中,加入5 0L1.0g/m L的同位素内标工作液,用甲醇-水溶 液(7 0+3 0)定 容 至 刻 度(含 杂 色 曲 霉 素 浓 度 为1n g/m L、2n g/m L、5n g/m L、1 0n g/m L、2 0n g/m L、3 0n g/m L、4 0n g/m L、5 0n g/m L系列标准溶液),临用前配制。3.5 材料3.5.1 免疫亲和柱:柱容量6 0 0n g(柱容量验证方法参见B.2)。3.5.2
7、 固相萃取柱:N-乙烯吡咯烷酮和二乙烯基苯共聚物填料柱(2 0 0m g/6m L),或相当者。使用前分别用5m L甲醇和5m L水活化。3.5.3 微孔滤膜:0.2 2m。4 仪器和设备4.1 液相色谱-串联质谱仪:配电喷雾离子源。4.2 高速粉碎机4.3 涡旋混合器。4.4 超声波发生器。4.5 天平:感量为0.0 1g和0.0 0 00 1g。4.6 离心机:转速60 0 0r/m i n。4.7 固相萃取装置(带真空泵)。4.8 氮吹仪。4.9 试验筛:1mm2mm孔径。5 分析步骤5.1 试样制备样品用高速粉碎机将其粉碎后过1mm2mm孔径试验筛,混合均匀后取试样1 0 0g用于检测
8、。5.2 试样提取称取5g均质试样(精确至0.0 1g)至5 0m L离心管中(花生和黄豆样品:称取2g均质试样),加入G B5 0 0 9.2 52 0 1 63 1 0 0L同位素内标工作液,加入2 0.0m L乙腈-水溶液(8 0+2 0),涡旋混匀后超声1 0m i n,在60 0 0r/m i n下离心1 0m i n,取上清液备用。5.3 净化5.3.1 固相萃取柱净化准确移取2.0m L上述上清液用水稀释至8m L待上样。将上样液转移至活化好的固相萃取柱中,控制样液以约3m L/m i n的速度稳定下滴。上样完毕后,依次加入5m L的乙腈-水溶液(4 0+6 0)、5m L的甲醇
9、-水溶液(4 0+6 0)淋洗。待淋洗结束后,用真空泵抽干固相萃取柱,加入6m L乙腈洗脱,控制流速为约3m L/m i n,用真空泵抽干固相萃取柱,收集洗脱液。在6 0下用氮气缓缓吹至干,用甲醇-水溶液(7 0+3 0)定容至1.0m L,涡旋3 0s溶解残留物,0.2 2m滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。按同一操作方法做空白试验。5.3.2 免疫亲和柱净化准确移取2m L上述上清液,加入2 8m LP B S混匀。将5 0m L一次性注射器筒与亲和柱的顶部相连。将上述样液移至注射器筒中,调节下滴速度,控制样液以约3m L/m i n的速度稳定下滴。待样液滴完后,往注射器筒内依次加入1
10、 0m LP B S和1 0m L水,以稳定流速淋洗免疫亲和柱。待水滴完后,用真空泵抽干亲和柱。在亲和柱下部放置1 0m L刻度试管,取下5 0m L的注射器筒,加入2m L乙腈洗脱亲和柱,控制约3m L/m i n的自然下滴速度,收集全部洗脱液至刻度试管中,用真空泵抽干亲和柱。在6 0下用氮气缓缓地将洗脱液吹至干,用甲醇-水溶液(7 0+3 0)定容至1.0m L,涡旋3 0s溶解残留物,0.2 2m滤膜过滤,收集滤液于进样瓶中以备进样。按同一操作方法做空白试验。注:可根据实验室实际情况,选择上述净化方法中的一种净化方法即可。5.4 仪器参考条件5.4.1 色谱参考条件a)液相色谱柱:C1
11、8柱,柱长1 0 0mm,内径2.1mm,粒径1.8m,或相当色谱柱;b)流动相:A相:水,B相:甲醇;c)梯度洗脱条件:7 0%B(0m i n 5m i n),1 0 0%B(5m i n 8m i n),7 0%B(8m i n 1 2m i n);d)流速:0.2m L/m i n;e)色谱柱柱温:4 0;f)进样量:1 0L。5.4.2 质谱参考条件a)检测方式:多离子反应监测(MRM);b)质谱条件及离子选择参数参见表A.1;c)子离子扫描图参见图A.1图A.2;d)液相色谱-质谱图见图A.3。5.5 标准曲线制作将标准系列工作溶液按浓度由低到高注入液相色谱-串联质谱仪中,测得相应
12、色谱峰的峰面积,以标准系列工作溶液中杂色曲霉素的浓度为横坐标,杂色曲霉素色谱峰的峰面积与同位素内标色谱峰的峰面积的比值为纵坐标,绘制标准曲线。G B5 0 0 9.2 52 0 1 64 5.6 试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱-串联质谱仪中,测得相应色谱峰的峰面积,根据标准曲线得到试样溶液中杂色曲霉素的浓度。如试样溶液中杂色曲霉素的浓度超出线性范围,则需适当减少取样量按5.2、5.3处理试样后重新测定。5.7 定性试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较,变化范围在2.5%之内。待测化合物定性离子色谱峰的信噪比3,定量离子色谱峰的信噪比1 0。每种化合物的质谱定性
13、离子必须出现,至少应包括一个母离子和两个子离子,而且同一检测批次,对同一化合物,样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比,其允许偏差不超过表1规定的范围。表1 定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度5 0%2 0%5 0%1 0%2 0%1 0%允许相对偏差2 0%2 5%3 0%5 0%6 分析结果的表述试样中杂色曲霉素的含量按式(1)计算:X=Vmf(1)式中:X 试样中杂色曲霉素的含量,单位为微克每千克(g/k g);由标准曲线得到的试样溶液中杂色曲霉素的浓度,单位为纳克每毫升(n g/m L);V 最终定容体积,单位毫升(m L);m 试样的称样量,单位克
14、(g);f 稀释倍数(f=1 0);计算结果保留三位有效数字。7 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的2 0%。8 其他称取大米、玉米及小麦试样5g时,其检出限为0.6g/k g,定量限为2g/k g;称取黄豆及花生试样2g时,其检出限为1.5g/k g,定量限为5g/k g。G B5 0 0 9.2 52 0 1 65 第二法 液相色谱法9 原理样品中的杂色曲霉素用乙腈-水溶液提取,经均质、涡旋、超声、离心等处理,取上清液用磷酸盐缓冲液稀释,免疫亲和柱净化、洗脱,氮气吹干浓缩、流动相定容、微孔滤膜过滤,液相色谱分离紫外检测器检测。外标法定量。1 0 试剂和
15、溶液除非另有说明,本方法使用试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。1 0.1 试剂和标准样品1 0.1.1 乙腈(CH3C N):色谱纯。1 0.1.2 甲醇(CH3OH):色谱纯。1 0.1.3 氯化钠(N a C l)。1 0.1.4 磷酸氢二钠(N a2H P O4)。1 0.1.5 磷酸二氢钾(KH2P O4)。1 0.1.6 盐酸。1 0.1.7 氯化钾(K C l)。1 0.2 试剂配制1 0.2.1 乙腈-水溶液(8 0+2 0):取8 0 0m L乙腈,加2 0 0m L水,混匀。1 0.2.2 乙腈-水溶液(5 0+5 0):取5 0 0m L乙腈,加5
16、0 0m L水,混匀。1 0.2.3 磷酸盐缓冲溶液(以下简称P B S):称取8.0g氯化钠,1.2g磷酸氢二钠(或2.9 2g十二水磷酸氢二钠),0.2g磷酸二氢钾,0.2g氯化 钾,用9 0 0 m L水溶解,用盐 酸调节p H至7.4,用水 定容至10 0 0m L。1 0.3 标准品杂色曲霉素标准品(C1 8H1 2O6,C A S号:1 0 0 4 8-1 3-2):纯度9 9%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。1 0.4 标准溶液配制1 0.4.1 标准储备溶液(1 0 0g/m L):准确称取杂色曲霉素标准品1.0m g(准确至0.0 1m g),用乙腈溶解并定容至1 0m L。溶液转移至试剂瓶中后,密封后-2 0下保存,保存期6个月。1 0.4.2 标准工作液(1g/m L):准确移取1 0 0L的杂色曲霉素标准储备溶液至1 0m L容量瓶中,用乙腈定容。此溶液浓度为1g/m L。-2 0下保存,保存期3个月。1 0.4.3 标准系列工作溶液:准确移取标准工作液适量至5m L容量瓶中,用乙腈-水溶液(5 0+5 0)定容至刻度(含杂色曲霉素浓度为5n g/m