1、123911990 中华人民共和国国家标准 中华人民共和国国家标准 食物中核黄素的测定方法 食物中核黄素的测定方法 Method for determination of riboflavin in foods Method for determination of riboflavin in foods GB/T 123911990 GB/T 123911990 1 主题内容与适用范围 1 主题内容与适用范围 本标准规定了用微生物法和荧光法测定食物中核黄素含量。本标准规定了用微生物法和荧光法测定食物中核黄素含量。本标准适用于各类食物中核黄的测定。本标准适用于各类食物中核黄的测定。第一篇 微生
2、物法 第一篇 微生物法 2 原理 2 原理 某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei，简称 L.C.）的生长需要核黄素；培养基中若缺乏这种维生素该细菌；便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况。以及它的代谢物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品中核黄素的含量。某一种微生物的生长（繁殖）必需某些维生素。例如干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei，简称 L.C.）的生长需要核黄素；培养基中若缺乏这种维生素该细菌；便不能生长。在一定条件下，该细菌生长情况。以及它的代谢物乳酸的浓度与培养
3、基中该维生素含量成正比，因此可以用酸度及混浊度的测定法来测定样品中核黄素的含量。3 试剂 3 试剂 本实验用水均需蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。本实验用水均需蒸馏水。试剂纯度均为分析纯。31 冰乙酸。31 冰乙酸。32 甲苯。32 甲苯。33 无水乙酸钠。33 无水乙酸钠。34 乙酸铅。34 乙酸铅。35 氢氧化铵。35 氢氧化铵。36 干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei ATCC 7489）。36 干酪乳酸杆菌（Lactobacillus casei ATCC 7489）。37 盐酸：0.1 mol/L。37 盐酸：0.1 mol/L。38 氢氧化钠：1 mol/L 和 0.
4、1 mol/L。38 氢氧化钠：1 mol/L 和 0.1 mol/L。39 0.9%氯化钠溶液（生理盐水）：使用前应进行灭菌处理。39 0.9%氯化钠溶液（生理盐水）：使用前应进行灭菌处理。310 核黄素标准储备液（25 ug/mL）：将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过 24 h 后。准确称取 50 mg，置于 2 L 容量瓶中，加入 2.4 mL 冰乙酸和 1.5 L 水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至 2 L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。310 核黄素标准储备液（25 ug/mL）：将标准品核黄素粉状结晶置于真空干燥
5、器或盛有硫酸的干燥器中。经过 24 h 后。准确称取 50 mg，置于 2 L 容量瓶中，加入 2.4 mL 冰乙酸和 1.5 L 水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室温，稀释至 2 L，移至棕色瓶内，加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。311 核黄素标准中间液（10 ug/mL）,准确吸取 20 mL 核黄素标准储备液，加水稀释至 50 mL。311 核黄素标准中间液（10 ug/mL）,准确吸取 20 mL 核黄素标准储备液，加水稀释至 50 mL。312 核黄素标准中间液（0.1 ug/mL），准确吸取 1.0 mL 中间液于 100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。每次
6、分析要配制新标准使用液。312 核黄素标准中间液（0.1 ug/mL），准确吸取 1.0 mL 中间液于 100 mL 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。每次分析要配制新标准使用液。313 碱处理蛋白胨：分别称取 40 g 蛋白胨和 20 g 氢氧化钠于 250 mL 水中。混合后，放于 370.5恒温箱内，2448 h 后取出，用冰乙酸调节 pH 至 6.8，加 14 g 无水乙酸钠（或 23.28 含有 3 分子结晶水的乙酸钠），稀释至 800 mL，加少许甲苯盛于溶液表面，于冰箱中保存。313 碱处理蛋白胨：分别称取 40 g 蛋白胨和 20 g 氢氧化钠于 250 mL 水中。混合后，放
7、于 370.5恒温箱内，2448 h 后取出，用冰乙酸调节 pH 至 6.8，加 14 g 无水乙酸钠（或 23.28 含有 3 分子结晶水的乙酸钠），稀释至 800 mL，加少许甲苯盛于溶液表面，于冰箱中保存。314 0.1%胱氨酸溶液：称取 1 gL胱氨酸于小烧杯中。加 20 mL 水，缓慢加入经约 510 mL 盐酸，直至其完全溶解，加水稀释至 1 L，加少许甲苯盖于溶314 0.1%胱氨酸溶液：称取 1 gL胱氨酸于小烧杯中。加 20 mL 水，缓慢加入经约 510 mL 盐酸，直至其完全溶解，加水稀释至 1 L，加少许甲苯盖于溶中华人民共和国卫生部 19900319 批准 19901
8、201 实施 中华人民共和国卫生部 19900319 批准 19901201 实施 123911990 液表面。液表面。315 酵母补充液：称取 100 g 酵母提取物干粉于 500 mL 水中、称取 150 g乙酸铅于 500 mL 水中。将两溶液混合，以氢氧化铵调节 pH 至酚酞量红色（取少许溶液检验）。离心或用布氏漏斗过滤，滤液用冰乙酸调节 pH 至 5.5。通入硫化氢直至不生沉淀。过滤，通空气于滤液中，以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。315 酵母补充液：称取 100 g 酵母提取物干粉于 500 mL 水中、称取 150 g乙酸铅于 500 mL 水中。将两溶
9、液混合，以氢氧化铵调节 pH 至酚酞量红色（取少许溶液检验）。离心或用布氏漏斗过滤，滤液用冰乙酸调节 pH 至 5.5。通入硫化氢直至不生沉淀。过滤，通空气于滤液中，以排除多余的硫化氢。加少许甲苯盖于溶液表面，于冰箱中保存。316 甲盐溶液：称取 25 g 磷酸氢二钾和 25 g 磷酸二氢钾，加水溶解，并稀释至 500 mL。加放少许甲苯以保存之。316 甲盐溶液：称取 25 g 磷酸氢二钾和 25 g 磷酸二氢钾，加水溶解，并稀释至 500 mL。加放少许甲苯以保存之。3 17 乙盐溶液：称取 10 g 硫酸镁（MgSO3 17 乙盐溶液：称取 10 g 硫酸镁（MgSO4 4 7H 7H2
10、 2），0.5 g 硫酸亚铁（FeSO），0.5 g 硫酸亚铁（FeSO4 47H7H2 2O）和 0.5 g 硫酸锰（MnSOO）和 0.5 g 硫酸锰（MnSO4 44H4H2O），加水溶解，并稀释至 500 mL，加少许甲苯以保存之。318 基本培养储备液：将下列试剂混合于 500 mL 烧杯中，加水至 450 mL，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 6.8，用水稀释至 500 mL。碱处理蛋白胨 100 mL 0.1%胱氨酸溶液 100 mL 酵母补充液 20 mL 甲盐溶液 10 mL 乙盐溶液 10 mL 无水葡萄糖 10 g 319 琼脂培养基：将下列试剂混合于 2
11、50 mL 三角瓶中，加水至 100 mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，用 1 mol/L 盐酸趁热调节 pH 至 6.8。尽快倒入试管中，每管 35 mL，塞上棉塞，于高压锅内在 5.9104Pa（10 lb/in2）压力下灭菌 15 min，取出后直立试管，冷至室温，于冰箱中保存。无水葡萄糖 1 g 乙酸钠（NaAc3H2O）1.7 g 蛋白胨 0.8 g 酵母提取物干粉 0.2 g 甲盐溶液 0.2 mL 乙盐溶液 0.2 mL 琼脂 1.2 g 320 0.04%溴甲酚绿指示剂：称取 0.1 g 溴甲酚绿于小研钵中，加 1.4 mL 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研
12、钵磨。用水稀释至 250 mL。321 0.04%溴麝香草酚蓝指示剂：称取 0.1 g 溴麝香草酚蓝于小研钵中，加1.6 mL 和 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨。加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至 250 mL。4 仪器与设备 41 实验室常用设备。42 电热恒温培养箱。43 离心沉淀机。44 液体快速混合器。45 离压消毒锅。5 菌种的制备与保存 2O），加水溶解，并稀释至 500 mL，加少许甲苯以保存之。318 基本培养储备液：将下列试剂混合于 500 mL 烧杯中，加水至 450 mL，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 6.8，用水稀释至 500 mL。
13、碱处理蛋白胨 100 mL 0.1%胱氨酸溶液 100 mL 酵母补充液 20 mL 甲盐溶液 10 mL 乙盐溶液 10 mL 无水葡萄糖 10 g 319 琼脂培养基：将下列试剂混合于 250 mL 三角瓶中，加水至 100 mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，用 1 mol/L 盐酸趁热调节 pH 至 6.8。尽快倒入试管中，每管 35 mL，塞上棉塞，于高压锅内在 5.9104Pa（10 lb/in2）压力下灭菌 15 min，取出后直立试管，冷至室温，于冰箱中保存。无水葡萄糖 1 g 乙酸钠（NaAc3H2O）1.7 g 蛋白胨 0.8 g 酵母提取物干粉 0.2 g 甲盐溶液 0.2
14、mL 乙盐溶液 0.2 mL 琼脂 1.2 g 320 0.04%溴甲酚绿指示剂：称取 0.1 g 溴甲酚绿于小研钵中，加 1.4 mL 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨，加少许水，继续研钵磨。用水稀释至 250 mL。321 0.04%溴麝香草酚蓝指示剂：称取 0.1 g 溴麝香草酚蓝于小研钵中，加1.6 mL 和 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨。加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至 250 mL。4 仪器与设备 41 实验室常用设备。42 电热恒温培养箱。43 离心沉淀机。44 液体快速混合器。45 离压消毒锅。5 菌种的制备与保存 中华人民共和国卫生部 19900319
15、 批准 19901201 实施 123911990 51 储备菌种的制备：以 LC纯菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中。在370.5恒温培养箱中保温 1624 h。贮于冰箱内，至多不超过 2 周，最好每周移种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用于制备接种液，一定要在使用前每天移种一次，连续 23 d 方可使用，否则生长不好。51 储备菌种的制备：以 LC纯菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中。在370.5恒温培养箱中保温 1624 h。贮于冰箱内，至多不超过 2 周，最好每周移种一次。保存数周以上的储备菌种，不能立即用于制备接种液，一定要在使用前每天移种一次，连续 23 d 方可使用，否
16、则生长不好。52 种子培养液的制备：取 5 mL 核黄素标准使用液和 5 mL 基本培养储备液于15 mL 离心管混匀，塞上棉塞，于高压锅内在 6.91052 种子培养液的制备：取 5 mL 核黄素标准使用液和 5 mL 基本培养储备液于15 mL 离心管混匀，塞上棉塞，于高压锅内在 6.9104 4Pa（10 lb/inPa（10 lb/in2）压力下灭菌 15 min。每次可制备 24 管。6 操作步骤 因核黄素易被日光和紫外线破坏，故一切操作要在暗室内进行。61 接种液的制备：使用前一天，将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中，同时制作二管。在 370.5保温 1624 h。取出后离心 10 min（3000 rpm），以无菌操作方法倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗二次，再加 10 mL消毒生理盐水，在液体快速混合器上振摇试管，使菌种成混悬体。将此液倾入已消毒的注射器内，立即使用。62 样品的制备 621 将样品用磨粉机、研钵磨成粉末或用打碎机打成匀浆。622 称取约含 510 ug 的核黄素样品（谷类约 10 g，干豆类约 4 g，肉类约 5 g），加入 50 mL0