1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准化妆品微生物标准检验方法 绿脓杆菌UDC 6 6 8.5 8:5 7 6 .8 5.0 7GB 7 91 8.4一 87S t a n d a r d me t h o d s o f mi c r o b i o l o g i c a l e x a mi n a t i o n f o r c o s me t i c s P s e u d o mo n p s a e r u g i n o s a 绿 脓 杆 菌在自 然 界 分布 甚广，空 气、水、土 壤中 均 有存 在。对人 有 致 病力，常引 起 人 皮 肤化 脓 感 染，特别是烧伤、
2、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症，因此，在化妆品卫生标准中规定不得检出绿脓杆菌。1 方法提要 根据本菌生物学特征:革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在4 2 条件下生长等，可与类似菌相区别。2 培养墓和试剂 2.1 S C D L P液体培养基 见G B 7 9 1 8.1-8 7 化妆品微生物标准检验方法总则。2.2 十六烷三甲基澳化馁培养基 成分:牛肉 膏3 g 蛋白陈l o g 氯化钠5 g 十六烷三甲基澳化按0.3 g 琼脂2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m 1 制法:除琼脂外，将上述成分混合加热溶解，调P H
3、为7.4-7.6，加入琼脂，1 1 5 C(1 0 1 b)2 0 m i n 灭菌后，制成平板备用。2.3 乙酞胺培养基 成分:乙酸胺1 0.O g 氯化钠5.0 g 无水磷酸氢二钾1.3 9 g 无水磷酸二氢钾0.7 3 g 硫酸镁(M g S O,7 H,O)0.5 g 酚红0.0 1 2 g 琼脂2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m 1 制法:除琼脂和酚红外，将其他成分加到蒸馏水中，加热溶解，调P H为7.2，加入琼脂、酚红，1 2 1 C中华人民共和国卫生部 1 9 8 7 一 0 5 一 2 8 批准1 9 8 7 一 1 0 一 0 1 实施GH 7 91 8.4 一 8 7(1
4、 5 l b)2 0 m i n 高压灭菌后，制成平板备用。2.4 绿脓菌色素测定用培养基 成分:蛋白陈2 0 g 抓化镁1.4 g 硫酸钾1 0 8 琼脂1 8 g 甘油(化学纯)l o g 燕馏水l 0 0 0 m l 制法:将蛋白陈、抓化镁和硫酸钾加到蒸馏水中.加温使溶解，调州 至7.4.加入琼脂和甘油，加热溶解，分装于试管内，1 1 5 C(1 0 1 b)2 0 m i n高压灭菌后，制成斜面备用。2.5 明胶培养基 成分:牛肉膏3 9 蛋白陈5 g 明胶1 2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m l 制法:取各成分加在燕馏水中浸泡2 0 m i n,随时搅拌加温使溶解，调p H至7.
5、4，分装于试管内，经1 1 5 C(1 0 1 b)2 0 m i n 灭菌后，直立制成高层备用。2.6 硝酸盐蛋白陈水培养基 成分:蛋白陈l o g 酵母浸青3 吕 硝酸钾2 g 亚硝酸钠0.5 g 燕馏水l o o o m l 制法:将蛋白陈和醉母浸膏加到蒸馏水中，加温使溶解，调p H为7.2,煮沸过滤后补足液量，加入硝酸钾和亚硝酸钠，溶解混匀，分装到加有小倒管的试管中，1 1 5 C(1 0 1 b)2 0 m i n 灭菌后备用。2.了 普通琼脂斜面培养基 成分:蛋白陈l o g 牛肉青3 g 抓化钠5 g 琼脂1 5 g 蒸馏水l o o o m l 制法:除琼脂外，将其余成分溶解于
6、燕馏水中，调叫 为7.2-7.4，加入琼脂，加热溶解，分装试管，1 2 1 C(1 5 1 b)1 5 m i n 高压灭菌后。制成斜面备用。3 仪器 3.1 3.2 3.35.43.53.63.73.8 1 4 4培养箱:3 7 C.4 2 C。锥形烧瓶。试管。灭菌平皿灭菌刻度吸管显微镜。载玻片。接种针、接种环。GB 7 91 8.4一 87:.。电炉。高压消毒锅。4 操作步吸4.1 增菌培养:取 1:1 0 样品稀释液 l O m l 加到 9 0 m l S C D L P液体培养基中，置 3 7 培养 1 8-2 4 h,如有绿脓杆菌生长，培养液表面多有一层薄菌膜，培养液常呈黄绿色或蓝
7、绿色。注:如无S C D L P液体培养基时，可用普通肉汤培养基。磷脂,7 g 吐温8 0,植脸含防腐剂的化妆品时，在每 1 0 0 0.1 普通肉汤中加 1 g卵 4.2 分离培养:从培养液的薄菌膜处挑取培养物，划线接种在十六烷三甲基澳化按琼脂平板上，置3 7 培养 1 8-2 4 h。凡绿脓杆菌在此培养基上，其菌落扁平无定型，向周边扩散或略有蔓延，表面湿润，菌落呈灰白色，菌落周围培养基常扩散有水溶性色素，此培养基选择性强，大肠艾希氏菌不能生长，革兰氏阳性菌生长较差。在缺乏十六烷三甲基澳化按琼脂时也可用乙酞胺培养基进行分离，将菌液划线接种于平皿中，放3 7 培养2 4 h，绿脓杆菌在此培养基
8、上生长良好，菌落扁平，边缘不整，菌落周围培养基略带粉红色，其他菌不生长 4.3 染色镜检:挑取可疑的菌落，涂片，革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性者应进行氧化酶试验。4.4 氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内，用无菌玻瑞棒挑取绿脓杆菌可疑菌落涂在滤纸片上，然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲 荃对笨二胺试液，在1 5-3 0 s 之内，出现粉红色或紫红色时，为氧化酶试验阳性，若培养物不变色，氧化酶试验阴性.4.5 绿脓菌素试验:取可疑菌落2-3 个，分别接种在绿脓菌素测定用培养基上，置3 7 C 培养2 4 h，加入氯仿 3-5 m l，充分振荡使培养物中的绿脓菌素溶解于抓仿液内，待抓
9、仿提取液呈蓝色时，用吸管将氯仿移到另一试管中并加入 1 N的盐酸 1 m l 左右，振荡后，静置片刻。如上层盐酸液内出现粉红色到紫红色时为阳性，表示被检物中有绿脓菌素存在。4.6 硝酸盐还原产气试验:挑取被检的纯培养物，接种在硝酸盆膝水培养基中，置3 7 培养2 4 h，观察结果。凡在硝酸盐陈水培养基内的小倒管中有气体者，即为阳性，表明该菌能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。4.7 明胶液化试验，取绿脓杆菌可疑菌落的纯培养物，穿刺接种在明胶培养基内，置3 7 1C 培养2 4 h,取出放冰箱 1 0 -3 0 m i n，如仍呈溶解状时即为明胶液化试验阳性，如凝固不溶者为阴性。4.8 4 2 生长试验:挑取纯培养物，接种在普通琼脂斜面培养基上，放在4 1 -4 2 培养箱中，培养2 4-4 8 h，绿脓杆菌能生长，为阳性，而近似的荧光假单胞菌则不能生长。5 检验结果报告 被检样品经增菌分离培养后，经证实为革兰氏阴性杆菌，氧化酶及绿脓菌素试验皆为阳性者，即可报告被检样品中检出有绿脓杆菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和 4 2 C 生长试验三者皆为阳性时，仍可报告被检样品中有绿脓杆菌附加说明:本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。本标准主要起草人周淑玉。本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释。