1、农业部1486号公告一9一2010饲料中氯烯雌醚的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了测定饲料中氯烯雌醚含量的高效液相色谱法(HPLC)。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料。本标准的检测限为0.1mg/kg,定量限为0.3mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3原理用乙腈从饲料中提取氯烯雌醚，离心后取上清液经过C1固相萃取小柱净
2、化，用高效液相色谱仪一紫外检测器在307nm处测定。外标法计算其含量。4试剂和材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂。4.1色谱分析用水符合GB/T6682中一级水的规定。4.2甲醇：色谱纯。4.3乙腈：色谱纯。4.425%氨水。4.5流动相：甲醇十水=82十18。4.6氯烯雌醚储备液：准确称取适量氯烯雌醚标准品（纯度95%），用甲醇(4.2)溶解、定容至100mL。此贮备液浓度为100ug/mL,密封贮于4冰箱内，有效期为一个月。4.7氣烯雌醚中间液：准确移取适量氯烯雌醚储备液(4.6)配制，保存于4冰箱内，有效期为一周。4.8标准T作溶液：分别准确移取氣烯雌醚储备液和中间液，用甲醇(
3、4.2)配制成标准工作溶液：0.05g/mL、1.0g/mL、2.0g/mL、5.0g/mL、10.0g/mL、20.0g/mL。现配现用。4.9淋洗液的配制：25%氨水(4.4)十水（一级）=5十95。4.10C8固相萃取小柱：200mg/3mL。5仪器和设备5.1实验室用样品粉碎机。5.2分析天平：感量0.1mg。5.3离心机：转速为5000r/min以上。农业部1486号公告一9一20105.4超纯水器。5.5超声波清洗器。5.6涡旋混合器。5.7振荡器。5.8密封盖塑料离心管：50mL。5.9固相萃取装置。5.10高效液相色谱仪：配备紫外检测器。5.11氨吹仪。6试样的制备按GB/T1
4、4699.1的规定采集试样后，按GB/T20195的规定，选取具有代表性的实验室样品1kg,四分法缩减分取200g左右，粉碎过1mm孔筛，混匀装人磨口瓶中备用。7分析步骤7.1提取准确称取配合饲料5g、浓缩饲料或添加剂预混合饲料称取2g(精确到0.01g),置于离心管(5.8)中，加入提取液乙腈(4.3)10.0mL,涡旋振荡2min。然后将离心管(5.8)置于振荡器(5.7)上振荡20min,然后在离心机(5.3)上以5000r/min离心5min,吸取上清液于另一具塞试管中，待净化。7.2SPE柱净化每一试样各准备一只C18小柱(4.10)，依次用3mL甲醇(4.2)、3mL蒸馏水、3mL
5、甲醇(4.2)活化。将提取液(7.1)3.0mL与等体积的蒸馏水混合均匀后，吸取5.0mL过此小柱（流速1.0mL/min)。用6mL淋洗液(4.9)淋洗，最后用3mL甲醇(4.2)洗脱，收集洗脱液于10mL试管内，洗脱液于50下用氮气吹干，残余物用1.0mL甲醇(4.2)定容，涡旋混合1min,过0.45m滤膜作为试样制备液，供高效液相色谱测定。7.3PLC测定参数的设定检测器：紫外检测器，检测波长：307nm;色谱柱：C1s柱，5am,250mm4.6mm,或性能类似的色谱柱；流动相：甲醇十水=82+18；流速：l.0mL/min;柱温：30；进样量：20uL。7.4HPLC测定取适量试样制备液(7.2)和相应浓度的标准工作溶液(4.8)，作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。当分析物浓度不在线性范围内时，应将分析物稀释或者浓缩后再进行检测。8定性8.1总则如果从峰形、测定数值对氯烯雌醚的峰产生怀疑，则必须用二极管阵列检测器(8.2)来定性。8.2二极管阵列检测器8.2.1条件色谱测定条件同7.3的规定，只是将紫外检测器换为二极管阵列检测器，具体参数如下：2