1、I C S 1 1.2 2 0B 4 1中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 8 9 3 6-2 0 0 3高致病性禽流感诊断技术D i a g n o s t i c t e c h n i q u e s f o r h i g h l y p a t h o g e n i c a v i a n i n f l u e n z a2 0 0 3 一 0 1 一 1 0发布2 0 0 3 一 0 5 一 01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发 布G B/T 1 8 9 3 6-2 0 0 3目 9舀 高致病性禽流感(h i g h l
2、y p a t h o g e n i c a v i a n i n f l u e n z a，简称H P A I)是由正猫病毒科流感病毒属中的A型流感病毒引起的，被世界动物卫生组织 Wo r l d O r g a n i z a t i o n f o r A n i m a l H e a l t h(英),O f f i c e I n t e r-n a t io n a l d e s E p iz o o t ie s(法),O I E 列为A类疾病，我国 将其列为一类动物疫病。本标准是参考O I E 诊断试验和疫苗标准手册(2 0 0。年版)，并结合我国现有动物卫生法规及农
3、业部对禽流感的相关政策和措施制定的。本标准的附录B、附录C、附录D、附录E、附录F为规范性附录，附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。本标准起草单位:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。本标准起草人:唐秀英、李海燕、田国斌。G B/T 1 8 9 3 6-2 0 0 3高致病性禽流感诊断技术范围 本标准规定了高致病性禽流感(H P A D 病毒分离与鉴定技术、血凝(HA)和血梁抑制(H I)试验、琼脂凝胶免疫扩散(A G I D)试验、酶联免疫吸附试验(间接E L I S A)的技术要求。本标准所规定的高致病性禽流感病毒分离与鉴定技术适用于
4、各种禽类高致病性禽流感的病原分离和鉴定;A G I D和间接E L I S A适用于A型禽流感病毒的型特异性检验:HA-H I 试验适用于禽流感病毒的血凝素亚型鉴定。2 病毒分离和鉴定技术2.1 材料准备2.1.1 病料的采集:死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品，进行分别处理或者同时处理;活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子，尤其是以采集气管拭子更好;小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜粪便。2.1.2 病料的保存:病料应放在含有抗菌素的p H值7.0-7.4 的等渗磷酸盐缓冲液(P B S)内(无P B S可用2 5%5 0%的甘油盐水)。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中
5、应含有青霉素(2 0 0 0 I U/m L),链霉素(2 m g/m l-)、庆大霉素(5 0 p g/m l-)和制霉菌素(1 0 0 0 I U/m l)，但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5 倍，加人抗生素后p H值应调至7.0-7.4。在室温放置1 h-2 h 后样品应尽快处理，没有条件的可在4 C 存放几天，也可于低温条件下保存(-7 0 C 贮存最好)。2.1.3 病料的处理:将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子;粪便、研碎的组织用含抗生素的p H值7.0-7.4 的等渗P B S 溶液配成1 0 写-2 0%(g/m L)的悬液。样品液经1 0 0 0 r/m i n 离心1
6、 0 m i n，取上清液作为接种材料。22 病毒分离2.2.1 样品接种:取处理好的样品，以0.2 m l 丫胚的量经尿囊腔途径接种 9日 龄-1 1日 龄 S P F鸡胚，每个样品接种5 个胚，于3 5 0C-3 7 0C 孵化箱内孵育，1 8 h 后每8h 观察鸡胚死亡情况。2.2.2 病毒收获:无菌收取1 8 h 以后的死胚及9 6 h 仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，阳性反应说明可能有正薪病毒科的流感病毒;若无血凝活性或血凝价很低，则用尿囊液继续传2 代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性2.3 病毒鉴定2-3.1 A型流感病毒的型特异性鉴定:样品接种鸡胚后，若鸡胚尿囊液具有血凝活性，
7、可用具有血凝活性鸡胚的绒毛尿囊膜(C A M)制成抗原，与A型禽流感病毒标准阳性血清进行 A G I D试验，检测样品中是否含有A型流感病毒。2,3.1.1 抗原制备:从具有血凝活性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，用p H 7.2 的P B S 冲洗后，将 C A M用研磨器磨碎磨碎的抗原反复冻融 3 次4 次，以 1 0 0 0 r/m i n离心 1 0 m i n后取上清，按终浓度为0.1%的量加人甲 醛溶液。置3 7 C 温箱灭活3 6 h 做灭活检验后即可作为A G I D试验用抗原，用禽流感标准阳性血清进行型特异性鉴定，若被检样品与标准阳性血清之间出现清晰的沉淀线即可判定样品中含有A型禽流
8、感病毒。2.3.1.2 A G I D试验方法:按本标准第 4 章中的方法进行。2.3.2 血凝素亚型鉴定:当鸡胚尿囊液具有血凝活性时，首先应排除血凝活性是否由新城疫、减蛋综合征等病毒引起，同时要注意是否有禽流感病毒与其他病毒混合感染。鸡胚尿囊液具有血凝活性或证明G B/T 1 8 9 3 6-2 0 0 3含有A型流感病毒存在后，采用 H A-H l 试验方法(按本标第 3 章中的方法进行)，用禽流感病毒 1 5 种血凝素(H 1-H1 5)亚型分型血清对样品进行病毒亚型鉴定。血凝素亚型鉴定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清，一般在国家指定的实验室进行。2.4 致病性测定 禽流感病毒致病性
9、测定应在具有高度生物安全性的实验室中进行，有以下两种方法，任选其一。2.4.1 静脉接种致病指数(I V P D测定法2.4.1.1 试验鸡:6 周龄 S P F鸡，1 0只。2.4.1.2 接种材料:感染鸡胚的尿囊液，血凝价在4 l o g:以上，未混有任何细菌和其他病毒。2.4.1.3 接种方法:将感染鸡胚尿囊液用生理盐水 1，1 0 稀释，以0.1 m L/羽的剂量翅静脉接种。2.4.1.4 每日 观察每只鸡的发病及死亡情况，连续观察 1 0 d，计算I V P I 值。计算方法参见附录A.2.4.1.5 判定标准:当I V P I 值大于1.2 时，判定此分离株为高致病性禽流感(H P
10、 A I)病毒株。2.4.2 致死比例测定法2.4.2.1 试验鸡 4 周龄,8 周龄 S P F鸡，8只。2.4.2.2 接种材料 感染鸡胚的尿囊液，血凝价在4 l o g:以上，未混有任何细菌和其他病毒。2.4.2.3 接种方法 将感染鸡胚尿囊液用生理盐水 1:1 0 稀释，以0.2 ml 了 羽的剂量翅静脉接种。每日观察鸡的死亡情况，连续观察1 0 d,2.4.2.4 判定方法2.4.2.4.1 接种1 0 d 内，能导致6 只7 只或8 只 鸡死亡，判定该毒株为高致病性禽流感病毒株。2.4.2.4.2 分离物能使1 只一5 只鸡致死，但病毒不是H 5 或H 7 亚型，则应进行下列试验:
11、将病毒接种于细胞培养物上，观察其在胰蛋白酶缺乏时是否引起细胞病变或形成蚀斑。如果病毒不能在细胞上生长，则分离物应被考虑为非高致病性禽流感病毒。2.4.2.4.3 对低致病性的所有H 5 或H 7 毒株和其他病毒，在缺乏胰蛋白酶的细胞上能够生长时，则应进行与血凝素有关的肚链的氨基酸序列分析，如果分析结果同其他高致病性流感病毒相似，这种被检验的分离物应被考虑为高致病性禽流感病毒。3 血凝(H A)和血凝抑制(H D试验技术3.1 材料准备3.1.1 9 6 孔v型微量反应板，微量移液器(配有滴头)。3.1.2 阿氏(A l s e v e r s)液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录B,3.1.3 p
12、 H7.2,0.0 1 m o l/L P B S,3.1.4 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。3.2 操作方法3.2.1 血凝(H A)试验(微量法)3.2.1.1 在微量反应板的1 孔1 2 孔均加入0.0 2 5 mL P B S，换滴头。3.2.1.2 吸取。.0 2 5 m L 病毒悬液(如感染性鸡胚尿囊液)加入第1 孔，混匀。3.2.1.3 从第 1 孔吸取。.0 2 5 m L病毒液加人第2 孔，混匀后吸取。.0 2 5 m L加人第3 孔，如此进行对倍稀释至第 1 1 孔，从第 1 1 孔吸取 0.0 2 5 ml弃之，换滴头。3.2.1.4 每孔再
13、加人 0.0 2 5 ml.P B S,3.2.1.5 每孔均加人0.0 2 5 m l体积分数为1%鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加人)见附录 B,G B/T 1 8 9 3 6-2 0 0 33.2.1.6 振荡混匀，在室温(2 0 C-2 5 C)下静置 4 0 m i n后观察结果(如果环境温度太高，可置 4 环境下)。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。3.2.1.7 结果判定:将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(H A U),3.2.2 血凝抑制(HD试验(微量法)3.2.2.1 根据3.2.1 试验结果配制4
14、 H A U的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以 4即为含 4 HA U的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为 1，2 5 6，则4 HA U抗原的稀释倍数应是 1，6 4(2 5 6 除以4),3.2.2.2 在微量反应板的1 孔1 1 孔加人0.0 2 5 m L P B S，第1 2 孔加人0.0 5 m L P B S,3.2.2.3 吸取。.0 2 5 m l血清加人第 1 孔内，充分混匀后吸0.0 2 5 m L于第2 孔，依次对倍稀释至第1 0 孔，从第 1 0 孔吸取0.0 2 5 m L弃去。3.2.2.4 1 孔1 1 孔均加人含4 H
15、A U混匀的病毒抗原液0.0 2 5 m L,室温(约2 0 V)静置至少3 0 m i n,3.2.2.5 每孔加人。.0 2 5 m L 体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约4 0 m i n(室温约2 0 C，若环境温度太高可置4 条件下进行)，对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底。3.3 结果判定 以完全抑制4 个 HA U抗原的血清最高稀释倍数作为 H I 滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于2 1 0 9 2,阳性对照孔血清误差不超过 1 个滴度，试验结果才有效。H I 价小于或等于3 1 0 9 2 判定 H I 试验阴性;H I 价等于4 l o g:为可疑，需重复试验;
16、H I 价大于或等于5 l o g:为阳性。4 琼脂凝胶免疫扩散(A G I D)试验4.1 材料准备4.1.1 硫柳汞溶液、p H 7.2,0.0 1 m o l/L P B S 溶液，配制方法见附录C,4.1.2 琼脂板:制备方法见附录D,4.1.3 禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性和阳性血清。4.2 操作方法4.2.1 打孔:在制备的琼脂板上按7 孔一组的梅花形打孔(中间1 孔，周围6 孔)，孔径约5 m m.孔距2 m m-5 m m，将孔中的琼脂用8 号针头斜面向上从右侧边缘插人，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。4.2.2 封底:用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要溶化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。4.2.3 加样:用微量移液器或带有6 -7 号针头的0.2 5 m L注射器，吸取抗原悬液滴人中间孔(图 1 的号)，标准阳性血清分别加人外周的和孔中，被检血清按编号顺序分别加人另外 4 个外周孔(图1的，号孔)。每孔均以加满不滋出为度，每加一个样品应换一个滴头。)/)-了 图 1 A G P试验结果4.2.4 作用:加样完毕后，静止 5 m i n-1 0