1、I C S6 7 0 5 0X0 4圆亘中华人民共和国国家标准G B T2 3 218 2 0 0 8动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定液相色谱一串联质谱法D e t e r m i n a t i o no fz e r a n o lr e s i d u e si na n i m a lo r i g i n a lf o o d L C M s-M Sm e t h o d2 0 0 8-1 2-3 1 发布2 0 0 9 0 6 0 1 实施宰瞀髁紫瓣訾糌赘星发布中国国家标准化管理委员会及1 1 1刖吾G B T2 3 2 1 8 2 0 0 8本标准的附录A、附录B 为资料性附
2、录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：方晓明、盛永刚、王敏、王传现、庞国芳。动物源性食品中玉米赤霉醇残留量的测定液相色谱一串联质谱法G B T2 3 2 1 8 2 0 0 81 范围本标准规定了动物源性食品中玉米赤霉醇(z e r a n 0 1)、口一玉米赤霉醇(口一z e a r a l a n 0 1)和玉米赤霉烷酮(z e a r a l a n o n e)残留量的高效液相色谱一串联质谱的测定方法。本标准适用于动物肌肉、肝脏，鱼肉、蛋和牛奶中玉米赤霉醇
3、、p 一玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮残留量的测定。本标准方法检出限为1p g k g。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。G B T6 3 7 9 1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1 部分：总则与定义(G B T6 3 7 9 1 2 0 0 4，I S O5 7 2 5 1：1 9 9 4，I D T)G B T6 3 7 9 2 测量方法与结果的准确
4、度(正确度与精密度)第2 部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法(G B T6 3 7 9 2 2 0 0 4，I S O5 7 2 5 2：1 9 9 4，I D T)G B T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法(G B T6 6 8 22 0 0 8，I S O3 6 9 6：1 9 8 7，M O D)3 原理样品经口一葡萄糖苷酸一硫酸酯复合酶水解后，用乙醚提取，提取液经液液分配、H L B 固相萃取柱净化后，用液相色谱一串联质谱仪测定，外标法定量。4 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合G B T6 6 8 2 一级水的标准。4 1 甲醇：色谱纯
5、。4 2 乙腈：色谱纯。4 3 无水乙醚。4 4 三氯甲烷。4 5 氢氧化钠。4 6 乙酸钠(N a A c 3 H：0)。4 7 磷酸：纯度大于8 5。4 8 冰乙酸。4 90 5m o l L 氢氧化钠溶液：称取2 0g 氢氧化钠，用水溶解并定容至1L。4 1 00 0 5m o l L 乙酸钠缓冲溶液：称取6 8g 乙酸钠，用9 5 0m L 水溶解，冰乙酸调节p H 值至4 8，定容至1I。4 1 1 磷酸溶液(1+4)：1 0m L 磷酸和4 0m L 水混合。4 1 2甲醇一水溶液(1+1)：5 0m L 甲醇和5 0m L 水混合。1G B T2 3 2 1 8 2 0 0 84
6、 1 3 口一葡萄糖苷酸酶一硫酸酯复合酶：9 60 0 0U m L 口一葡萄糖苷酸酶；3 9 0u m L 硫酸酯酶(H 一2，f o r mh e l i xp o m a t i a)。4 1 4 玉米赤霉醇、口一玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮标准物质：纯度9 9。4 1 51 0 0t t g m L 标准储备溶液：分别准确称取适量标准品(精确至0 1r a g)，用乙腈溶解，配制成浓度为1 0 0t t g m L 的标准储备溶液。一1 8 以下冷冻避光保存。4 1 61 0t t g m L 和1 0g g m L 的混合标准中间溶液：分别准确吸取1 0m L 和0 1 0m L 标准储
7、备溶液(4 1 5)于2 0m L 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为1 0 z g m L 和1 0p g m L 混合标准中间溶液。0 4 冷藏避光保存。4 1 7 基质混合标准工作溶液：根据需要，取适量的混合标准中间溶液(4 1 6)，用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准溶液。基质混合标准工作溶液现用现配。4 1 8O a s i sH L B 固相萃取柱”或相当者：5 0 0r a g 6m L。使用前分别用5m L 甲醇和5m L 水预淋洗。4 1 9 滤膜：0 2 0p m。5 仪器和设备5 1 液相色谱一串联质谱仪：配有电喷雾离子源(E S I)。5 2 组织捣碎机。
8、5 3 分析天平：感量0 1m g 和0 0 1g。5 4 移液器：1 0p L 1 5 0p L、l o op L 1o 旺。5 5 均质器：1 00 0 0r r a i n。5 6 涡旋混合器。5 7 恒温振荡器。5 8 离心机：40 0 0r r a i n。5 9p H 计：测量精度士0 0 2p H 单位。5 1 0 氮吹仪。5 1 1 固相萃取装置。5 1 2 具塞离心管：5 0m L。5 1 3 刻度试管：1 0m L。6 试样的制备与保存6 1 试样的制备实验室样品用组织捣碎机绞碎，分出o。5k g 作为试样。6 2 试样保存试样置于一1 8 冰箱，避光保存。7 测定步骤7
9、1 样品处理7 1 1 水解称取5g 试样(精确至o，0 1g)于5 0m L 具塞离心管中。加入1 0m L 乙酸钠缓冲溶液(4 1 0)和0 0 2 5m L 8-葡萄糖苷酸一硫酸酯复合酶(4 1 3)，旋涡混匀，于3 7 水浴中振荡1 2h。7 1 2 提取水解后加入1 5m L 无水乙醚，振荡提取5r a i n 后，以40 0 0r r a i n 离心2m i n，将上清液转移至浓缩21)O a s i sH L B 固相萃取柱是W a t e r s 公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等
10、效产品。G B T2 3 2 1 8 2 0 0 8瓶中，再用1 5m L 无水乙醚重复提取一次，合并上清液，4 0 以下旋转浓缩至近干。残留物加1 0m L三氯甲烷溶解后，转入1 0m L 离心管中，再用3m L 氢氧化钠溶液(4 9)润洗浓缩瓶后转移至同一离心管中，旋涡混匀，以40 0 0r r a i n 离心2 m i n，吸取上层氢氧化钠溶液。再用3 m L 氢氧化钠溶液(4 9)重复润洗、萃取一次，合并氢氧化钠溶液，加入1m L 磷酸溶液(4 1 1)，混匀后待净化。7 1 3 净化将样品提取液(7 1 2)转入H L B 固相萃取柱(4 1 8)。用5m L 水、5m L 甲醇一
11、水溶液(4 1 2)淋洗，弃去；再用1 0m L 甲醇进行洗脱，收集洗脱液。整个固相萃取净化过程控制流速不超过2m L m i n。洗脱液在4 0 以下用氮气吹干。残留物用1-0m L 乙腈溶解，旋涡混匀后，过0 2b t m 滤膜，供仪器测定用。7 2 测定条件7 2 1 液相色谱参考条件a)色谱柱：C 1 8，2 z m，5 0m m X2 0r a m(内径)或相当者；b)柱温：4 0；c)流速：0 2m L m i n；d)进样量：5p L；e)流动相及梯度洗脱条件见表1。表1 流动相及梯度洗脱条件时间r a i n乙腈水02 57 557 03 067 03 092 57 57 2
12、2 质谱参考条件a)电离方式：电喷雾电离(E S I)；b)离子源喷雾电压(I S)：35 0 0V；c)离子源温度(T E M)：3 5 0；d)喷雾气流量：1 1L m i n；e)扫描方式：负离子扫描；f)检测方式：多反应监测(M R M)，监测条件见表2。表2 多反应监测条件化合物中文名称化合物英文名称母离子(m z)子离子(m z)去簇电压v碰撞能量V2 7 7 2 51 6 01 7口玉米赤霉醇口z e a r a l a n 0 13 2 1 13 0 3 21 6 01 72 7 7 2 1 7 01 6玉米赤霉醇z e 8 r a a n o I3 2 1 13 0 3 21
13、 7 01 62 7 5 1 41 7 01 6玉米赤霉烷酮3 1 9 13 0 1 11 7 01 6a 离子用于定量。7 2 3 液相色谱一串联质谱测定7 2 3 1 定性测定每种被测组分选择一个母离子，两个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间3G B T2 3 218 2 0 0 8与基质混合标准工作溶液中对应物质的保留时间偏差在2 5 之内；且样品谱图中各定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，若偏差不超过表3 规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度 5 02
14、 0 5 01 0 2 0 1 0允许相对偏差土2 0士2 5土3 0士5 07 2 3 2 定量测定在仪器最佳工作条件下，用基质混合标准工作溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，以基质混合标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，口一玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷标准物质的多反应监测(M R M)色谱图参见图A 1、图A 2 和图A 3。本标准的添加回收率数据参见表B 1。7 3 平行试验按以上步骤，对同一样品进行平行试验测定。7 4 空白试验除不称取样品外，均按上述步骤进行。8 结果计算p
15、玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮残留量的测定按式(1)计算：x c 筹揣(1)仇U U U式中：x 试样中被测组分残留量，单位为微克每千克(t,g k g)；c从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度，单位为纳克每毫升(n g m L)；V 样品溶液定容体积，单位为毫升(m L)；m 样品溶液所代表试样的质量，单位为克(g)。计算结果应扣除空白值。9 精密度9 1 一般规定本标准的精密度数据是按照G B T6 3 7 9 1 和G B T6 3 7 9 2 的规定确定的，重复性和再现性的值以9 5 的可信度来计算。9 2 重复性在重复性试验条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性
16、限r，试样中口一玉米赤霉醇、玉米赤霉醇和玉米赤霉烷酮的添加浓度范围及重复性方程见表4。表4添加浓度范围及重复性和再现性方程单位为毫克每千克样品基质化合物名称添加浓度范围重复性限r再现性限R口一玉米赤霉醇1 1 0l g r=0 8 6 06l g 优一0 5 3 84l g R=0 8 7 33l g，lO 6 0 27猪肝玉米赤霉醇1 1 0l g r-0 7 4 93l g m 一0 4 3 74l g R=0 7 9 21l g m0 5 3 94玉米赤霉烷酮1 1 0l g r=O8 7 841 9 m 一0 4 5 89l g R=0 9 2 82l g m 一0 5 5 56G B T2 3 2 1 8 2 0 0 8袁4(续)单位为毫克每千克样品基质化合物名称添加浓度范围重复性限r再现性限R户玉米赤霉醇1 1 0l g r=0 8 6 31l g m 一0 5 0 30l g R=0 8 9 91l g m 一0 5 0 27牛肉玉米赤霉醇1 1 0l g r-0 8 8 56l g m O 4 3 19l g R=0 9 1 761 9 m 一0 4 8 31玉米赤霉烷