1、GB/T31730一2015水稻中转基因成分测定膜芯片法1范围本标准规定了水稻及水稻加工产品中转基因成分的检测方法。本标准适用于转BAR基因耐除草剂水稻和转Bt基因(Cry1Ab/CrylAc)抗虫水稻中转基因成分的快速定性检测，也适用于水稻加工产品中以上成分的快速定性检测。本标准规定的转基因成分最低检测限量是1g/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T1
2、9495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法3术语、定义和缩略语3.1术语和定义GB/T19495.1、GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)?dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)dCTP:脱氧
3、胞苷三磷酸(deoxycytidine triphosphate).dGTP:脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphate)dTTP:脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphate)dUTP:脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridine triphosphate)bp:贼基对(base pair)BAR:草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene).CrylAb:苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白crylA(b)基因Bacillus thuringiensis insecticidal toxincr
4、y1A(b)geneCry1Ac:苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白crylA(c)基因Bacillus thuringiensis insecticidal toxincrylA(c)gene1GB/T31730-2015CaMV35S-P:花榔菜花叶病毒的35S启动子(promoter from cauliflower mosaic virus).NOS3:胭脂碱合成酶基因终止子(termination sequence of the nopaline synthase gene)CaMV35ST:花椰菜花叶病毒的35S终止子(termination sequence from cauliflowe
5、r mosaic virus),GOS9:水稻gos9基因Oryza sativa(rice)gos9genePC:阳性对照(positive control).NC:阴性对照(negative control)UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)(uracil N-glycosylase)Taq酶：Thermus aquaticus DNA聚合酶(Thermus aquaticus DNA polymerase)AminolinkerC6:6个碳原子作为连接臂的氨基标记(C6 Amino linker)4原理根据转基因水稻中常见转基因片段和调控元件设计特异性多重PCR引物，对样本进行多
6、重PCR扩增。PCR引物上修饰有生物素。若样本中出现目标片段而得到PCR扩增产物，PCR产物与固定有目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交。杂交点上的生物素和碱性磷酸酶标记链霉亲和素反应，以及碱性磷酸酶化学显色底物进行化学显色，则可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号。依据膜芯片上杂交点的显色情况，判断样本中是否含有待检转基因成分，检测结果可以用肉眼直接判断，或用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。5试剂与标准品5.1试剂5.1.1试剂组分本标准中试剂组分和存放条件参见附录A和5.1.25.1.4的规定。除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。5.1.2引物PC
7、R反应使用的引物序列应符合表1的规定。表1PCR反应使用的引物序列目标基因引物名称序列扩增片段大小Forward5-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3BAR193bpReverse5-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTCCA-3Forward5-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3CrylAb164bpReverse5-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3Forward5-GTTAGACTCAACAGCAGTGGA-3CrylAc161bpReverse5-biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA-3*Forward5-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3CaMV35S-P144bpReverse5-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3