1、ICS65.020.01B04中华人民共和国国家标准农业部2122号公告一4一2014转基因植物及其产品成分检测耐除草剂和品质改良大豆MON87705及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived products-Qualitative PCR method for herbicide-tolerant and quality improved soybeanMON87705 and its derivates2014-07-07发布2014-08-01实施中华人民共和国农业部发布农业部2122号公告一4一2
2、014按农业部2031号公告一19一2013的规定执行。7.2试样制备按NY/T672和农业部2031号公告-19一2013的规定执行。7.3试样预处理按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.4DNA模板制备按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.5PCR反应7.5.1试样PCR反应7.5.1.1大豆内标准基因PCR反应按农业部2031号公告一8一2013的规定执行。7.5.1.2转化体特异性序列PCR反应7.5.1.2.1每个试样PCR反应设置3次平行。7.5.1.2.2在PC反应管中按表1依次加人反应试剂，混匀，再加25L石蜡油（有热盖功能的PCR仪可不加)。也可采
3、用经验证的、等效的定性PC反应试剂盒配制反应体系。7.5.1.2.3将PCR管放在离心机上，500g3000g离心10s,然后取出PCR管，放人PCR仪中。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积水10XPCR缓冲液12.5L25 mmol/L氯化镁溶液1.5 mmol/L1.5LdNTPs:混合溶液（各2.5mmol/L)各0.2mmol/L2.0L10 umol/L MON87705-F0.4 umol/L1.0L10 umol/L MON87705-R0.4 umol/L1.0LTaq DNA聚合酶0.025U/L25mg/LDNA模板2 mg/L2.0L总体积25.0L“一”表示体积不确定
4、。如果PCR缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液。根据Taq DNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0L。7.5.1.2.4进行PCR反应。反应程序为：95变性5min;95变性30s,58退火30s,72延伸30s,共进行35次循环；72延伸7min。7.5.1.2.5反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。7.5.2对照PCR反应在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因大豆基因组DNA作为阴性对照；以转基因大豆MON87705质量分数为0.1%1.0%的大豆基因组DNA,或采用转基因大豆MON87705转化体特异性序列与非转基因大豆基因组相比的拷贝数分数为0.1%1.0%的DNA溶液作为阳性对照；以水作为空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外，其余组分及PCR反应条件与7.5.1.1和7.5.1.2相同。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100L琼脂糖溶液中加入5LEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放人1XTAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12LPCR产物与3L加样缓冲液混合后3