1、ICs65.020.01B04中华人民共和国国家标准农业部2406号公告一5一2016转基因生物及其产品食用安全检测外源蛋白质致敏性人血清酶联免疫试验Food safety detection of genetically modified organisms and derivedproducts-Test method of allergenicity of exogenous protein by ELISA withhuman serum2016-05-23发布2016-10-01实施中华人民共和国农业部发布农业部2406号公告一5-2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的
2、规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业部提出本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会(SAC/TC276)归口。本标准起草单位：农业郭科技发展中心、中国农业大学、中国疾病预防和控制中心营养与健康所、北京大学第三医院、广州医学院本标准主要起草人：黄昆仑会莲、宋贵文尧光、周薇、卓勤、陶爱林、罗云波许文涛、周催、毕源GEARCH C农业部2406号公告一5一2016转基因生物及其产品食用安全检测外源蛋白质致敏性人血清酶联免疫试验1范围本标准规定了采用酶联免疫吸附试验方法检测转基因生物外源基因表达的蛋白质致敏性的设计原
3、则、指标测定和结果判定。本标准适用于采用酶联免疫试验方法检测转基因生物外源基因表达的蛋白质与人源性特异性IgE抗体结合能力2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1人血清特异性IgE Human specific immunoglobulin E过敏患者血清中能与某种过敏原特异性结合的免疫球蛋白E。4原理采用酶联免疫方法检测转基因生物外源基因表达蛋白质与过敏患者血清中特异性gE
4、的结合能力，通过检测450nm处吸光度来判断结合量，判断转基因生物外源基因表达的蛋白质是否具有潜在致敏性。5试剂和材料使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水，除非另有说明。5.1过敏患者血清：含过敏原（有致敏性的基因供体生物的蛋白提取物或与待测蛋白质氨基酸序列有同源性的过敏蛋白)特异性IgE的过敏患者血清。5.2阴性对照血清：健康人的血清。经检测总IgE在0IU/mL333.0IU/mL,且不具基因供体生物的蛋白提取物或与待测蛋白质氨基酸序列有同源性的过敏蛋白的特异性1gE5.3磷酸缓冲液(pH7.5):称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、2.9g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾，加入
5、800mL水充分溶解，HCl或NaOH调pH至7.5，定容至1000mL。5.4包被缓冲液(0.05mol/L碳酸钠缓冲液，pH9.6):称取0.53g碳酸钠与0.42g碳酸氢钠，加80mL水充分溶解，HCl或NaOH调pH至9.6，定容至100mL。5.5洗涤液：量取1000mL磷酸缓冲液，加入1mL吐温-20，搅拌均匀。5.6封闭液：量取100mL磷酸缓冲液，加入1.0g牛血清白蛋白，搅拌均匀。现用现配。5.7抗体稀释液：量取100mL磷酸缓冲液，加入0.1g牛血清白蛋白，搅拌混匀。现用现配。1农业部2406号公告一5一20165.8底物缓冲液：称取0.47g柠檬酸，1.83g磷酸氢二钠，
6、加80mL水混匀，HC1或NaOH调pH至5.0,加水定容至100mL。5.9底物工作液：称取10mg四甲基联苯胺(TMB)溶于1mL二甲基亚砜中，混匀后，4避光放置。临用前，取50LTMB溶液加入10mL底物缓冲液中，再加入10：L30%过氧化氢溶液。5.10终止液(2mol/L硫酸)：量取11.11mL18mol/L浓硫酸，缓慢加入70mL水中，边加边搅拌，待温度降至室温后，加水定容至100mL。5.11二抗：生物素标记的抗人IgE抗体5.12链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶。6仪器和设备OSLISHING RESEAR6.1电子天平：感量分别为0.1g,0.06.2酶标仪。6.3移液器。6
7、.4加样槽。6.5.+0.16.6重蒸馏水发生器或级个7分析步骤7.1样品制备7.1.1待测蛋白质为米源于转基因植物动物或微生物中外源基因表达的重组蛋占质7.1.2阳性对照蛋白质为基因供体生物的蛋白提取物或与得测蛋白质氨基酸序列有同源性的过敏蛋白。7.1.3称取待测蛋自样盈,用包被缓冲液，充分溶解。浓度为10 ug/mlm7.2人体血清07.2.1选取至少6份未已知过敏原特异性gE的健康人血清，等比例泥合，作为阴性对照血清。m7.2.2选取对基因供体生物或与？测蛋白质氨基酸序列有同源性的过敏蛋白过敏的患者血清。7.2.2.1如果基因供体生物或与待测蛋白质氨基酸序列有同源性过敏原的致敏性较强（即
8、血清中含有特异性1gE的人数多于50%，则至少选择8份以上过敏患者的血清。7.2.2.2如果基因供体生物或5待测蛋白质氨基酸序列有同源性过敏原的致敏性较弱（即血清中含有特异性1gE的人数少于50%)，则至少选择24份以上对该生物过敏的患者血清。7.2.3检测过敏患者血清进行特异性1gE水平，浓度大于3.5kUA/L或大于级的，可作为阳性血清。7.2.4每份过敏患者血清均应单独进行检测和后续试验。7.3 ELISA方法7.3.1包被：在96孔板上选择需要包被的孔，加入包被缓冲液作为空白对照，其他孔分别加人待测蛋白质或阳性对照蛋白质溶液，每孔加入100L,4过夜。7.3.2洗涤：倒掉孔内液体，每孔
9、加入洗涤液200L,室温放置3mi,洗板机洗板或者甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复3次。7.3.3封闭：每孔加入150L封闭液，于37恒温培养箱中温育1h,洗涤3次。2农业部2406号公告5一20167.3.4加一抗：用封闭液以1：10稀释阴性对照血清混合样品和过敏患者血清，于37恒温培养箱中孵育1.5h。在空白对照孔和阳性对照蛋白质孔中加入阴性对照血清混合样品；在待测蛋白质孔和阳性蛋白质孔中加入过敏患者血清。每孔加入100L,每种处理做3个平行孔。于37恒温培养箱中温育2h,洗涤3次7.3.5加二抗：用抗体稀释液以1：1000稀释生物素标记的抗人1gE抗体，每孔加人10
10、0L,置于37恒温培养箱中温育1h,洗涤3次。7.3.6加辣根过氧化物酶：用抗体稀释液以1：2000稀释链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶，每孔加入100L,置于37恒温培养箱中温育1h,洗涤6次。7.3.7显色：每孔加入新鲜配制的底物工作液150L,置于37恒温培养箱中，显色5min15min,每孔加入50L终止液。7.3.8结果测定：于30min内用酶标仪测定各孔波长为450nm时的吸光度。7.3.9结果判定：以吸光度大于或等于阴性对照血清孔吸光度平均值2倍的样品为阳性结果。8结果表述8.1试验体系评价所有阴性对照蛋白质与阴性对照血清孔吸光度为阴性结果，且所有阳性对照蛋白质与过敏患者血清孔的吸光度大于或等于阴性对照血清孔吸光度平均值的2倍，说明试验体系正常。否则重新检测。8.2试验结果表述8.2.1待测蛋白质与过敏患者血清孔吸光度平均值均为阴性结果，说明待测蛋白质与过敏患者血清中的特异性IgE未发生免疫反应，结果表述为：“该蛋白质不能与过敏原的特异性IgE结合”。8.2.2待测蛋白质与过敏患者血清孔吸光度平均值有阳性结果，说明待测蛋白质与过敏患者血清中的特异性IgE发生免疫反应，结果表述为：“该蛋白质可以与过敏原的特异性1gE结合”。