1、ICS65.020.01B04中华人民共和国国家标准农业部2259号公告一8一2015转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆FG72及其衍生品种定性PCR方法Detection of genetically modified plants and derived products-Qualitative PCR method for herbicide-tolerant soybean FG72 and itsderivates2015-05-21发布2015-08-01实施中华人民共和国农业部发布农业部2259号公告8-2015转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆FG72及其衍生品种定性P
2、CR方法1范围本标准规定了转基因耐除草剂大豆FG72转化体特异性定性PCR检测方法。本标准适用于转基因耐除草剂大豆FG72及其衍生品种，以及制品中FG72转化体成分的定性PCR检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法农业部1485号公告一4一2010转基因植物及其产品成分检测DNA提取和纯化农业部2031号公告一8一2013转基因植物及其产品成分检测大豆内标准基因定性PCR方法农业部2031号公告一19一2013转
3、基因植物及其产品成分检测抽样NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求3术语和定义农业部2031号公告一8一2013界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1FG72转化体特异性序列event-specific sequence of FG72FG72外源插入片段3端与大豆基因组的连接区序列，包括转化载体部分序列和大豆基因组序列。4原理根据转基因耐除草剂大豆FG72转化体特异性序列设计特异性引物，对试样进行PC扩增。依据是否扩增获得预期的DNA片段，判断样品中是否含有FG72转化体成分。5试剂和材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.1琼脂糖。5
4、.210g/L溴化乙锭溶液：称取1.0g溴化乙锭(EB),溶解于100mL水中，避光保存。警告一溴化乙锭有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。5.310mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入80.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL5.4500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液(pH8.0):称取18.6g乙二铵四乙酸二钠(EDTA-Naz),加人T0mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液直至EDTA-Nae完全溶解，用氢氧化钠溶液调pH至8.0，加水定容至100mL。在103.4kPa(121)条件下灭菌20min5.51mol/L三羟甲基氨基
5、甲烷一盐酸溶液(pH8.0):称取121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tis)溶解于1农业部2259号公告8-一2015按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.4DNA模板制备按农业部1485号公告一4一2010的规定执行。7.5PCR扩增7.5.1试样PCR扩增7.5.1.1大豆内标准基因PCR扩增按农业部2031号公告一82013中7.5.1.1.1的规定执行。7.5.1.2转化体特异性序列PCR扩增7.5.1.2.1每个试样PCR设置3次平行。7.5.1.2.2在PCR管中按表1依次加入反应试剂，混匀，再加25L石蜡油（有热盖功能的PCR仪可不加)。也可采用经验证的、等效的定性PC
6、R试剂盒配制反应体系。表1PCR检测反应体系试剂终浓度体积水10XPR缓冲液1X2.5L25mmol/L氯化镁溶液1.5 mmol/L1.5LdNTPs混合溶液（各2.5mmol/L)各0.2mmol/L2.0L10mol/L上游引物FG72-F0.4 umol/L1.0L10mol/L下游引物FG72-R0.4 umol/L1.0LTag DNA聚合酶0.025U/L25mg/LDNA模板2 mg/L2.0L总体积25.0L“一”表示体积不确定。如果PCR缓冲液中含有氟化镁，则不加氯化镁溶液，根据Taq DNA聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到25.0L。7.5
7、.1.2.3将PCR管放在离心机上，500g3000g离心10s,然后取出PCR管，放人PCR扩增仪中。7.5.1.2.4进行PCR扩增。反应程序为：94变性3min;94变性30s,58退火30s,72延伸30s,共进行35次循环；72延伸5min7.5.1.2.5PCR结束后取出PCR管，对PCR扩增产物进行电泳检测。7.5.2对照PCR扩增在试样PCR扩增的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。以非转基因大豆基因组DNA作为阴性对照；以含有转基因耐除草剂大豆G72质量分数为0.1%一1.0%的大豆基因组DNA作为阳性对照，或采用转基因耐除草剂大豆FG72转化体特异性序列与非转基因大豆基因组相比的拷贝数分数为0.1%1.0%的DNA溶液作为阳性对照；以水作为空白对照。除DNA模板外，对照PCR扩增与7.5.1相同。7.6PCR产物电泳检测按20g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100L琼脂糖溶液中加入5LEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12LPCR产物与3L加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加人DNA分子量标准，接通电源在2V/cm5V/cm条件下电泳检测。7.7凝胶成像分析3