1、ICS65.120B46中华人民共和国国家标准农业部2483号公告一1一2016饲料中炔雌醚的测定高效液相色谱法Determination of quinestrol in feeds-High performance liquid chromatography2016-12-23发布2017-04-01实施中华人民共和国农业部发布农业部2483号公告一1一2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由农业部畜牧业司提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC76)归口。本标准起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（济南）。本标准主要起草人：宫玲玲、李会荣
2、、张芸、战余铭、李斌、张玮、李祥明。I农业部2483号公告一1一2016饲料中炔雌醚的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中炔雌醚含量测定的高效液相色谱法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中炔雌醚的测定。本标准的检出限为0.5mg/kg,定量限为1mg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备农业部2483号公告一3一
3、2016饲料中炔雌醚的测定液相色谱一串联质谱法3原理试样中炔雌醚用乙腈提取，提取液经固相萃取柱净化吹干后用乙腈溶解，高效液相色谱仪测定，外标法定量。4试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯和符合GB/T6682规定的一级用水。4.1乙腈。4.2乙腈：色谱纯。4.3甲醇。4.4乙腈溶液：乙腈+水=1+3。4.5炔雌醚标准品：纯度99%。4.6炔雌醚标准储备溶液：精密称取炔雌醚标准品(4.5)100mg,置于10mL容量瓶中，用乙腈(4.2)定容，配成浓度为10mg/mL的标准储备溶液。28冷藏保存，有效期为6个月。4.7炔雌醚标准中间溶液：准确移取炔雌醚标准储备溶液(4.6)1mL置于10m
4、L容量瓶中，用乙腈(4.2)定容至刻度。该溶液中炔雌醚的浓度为1mg/mL。28冷藏保存，有效期为3个月。4.8炔雌醚标准工作溶液：准确移取炔雌醚标准中间溶液(4.7)适量，用乙腈(4.2)稀释成浓度分别为0.50g/mL、1.00ug/mL、5.00g/mL、10.00g/mL、20.00g/mL、50.00ug/mL和100.00ug/mL的标准工作溶液。现用现配。4.9固相萃取柱：C1s,200mg/3mL:或其他性能类似的小柱。4.10微孔滤膜：0.22um,有机相。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器，波长230nm。1农业部2483号公告一1一20165.2分析天平：感
5、量为0.1mg。5.3分析天平：感量为1mg。5.4氮吹仪5.5振荡器5.6固相萃取装置。5.7旋涡混合器。6采样和试样制备按GB/T14699.1的规定抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样。按GB/T20195的规定制备试样，粉碎过0.45mm孔径筛，充分混匀，称取（配合饲料g淡DAR7分析步骤7.1试样提取和预混ge队nL离心管中，准确加个15ml乙腈(4.)，充分振少min,然爪静置沉5him。取.00mL20ml试管中，加人12mL水混匀备用。7.2试液净化及制备固相萃取柑依次用3h甲醇(4.3、3m水活化。将试液(7.1过柱（流速mmin),用3ml乙腈溶液(4.4)林洗mL乙腈
6、(4.)洗脱，收集洗脱液，氨吹仪上50至干，亿腈(4.2)溶解，过0.22滤膜上机测定。若试液中炔雌醚的浓度超出标准工作溶液的：线范围，进样前用一定体积的乙腈(4.2)稀留使稀释后上机试液中的决雌醚浓度在标准工作溶液的线性范围内。7.3测定7.3.1液相色谱参考件色谱柱：C1s,柱长25nm,内径4.6mm,粒径5m;或他效果等司同的C柱温：40。波长：230nm。流动相：乙腈(42)-203N流速：l.0mL/min。进样量：50L。7.3.2定性测定在仪器最佳工作条件下，祥品中待测物的保留时间与炔雌醚工作溶液中对应的保留时间相对偏差在士2.5%之内，则可判定为样品中存在对应的待测物。如需进
7、一步确认，可采用农业部2483号公告3一2016规定的方法检测。7.3.3定量测定在仪器最佳工作条件下，分别上机测定标准工作溶液(4.8，从低浓度到高浓度)和试样溶液中炔雌醚的峰面积。以标准工作溶液中炔雌醚的浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线多点校准或以标准工作溶液单点进行定量。试样溶液中炔雌醚的峰面积应在标准工作溶液测定的线性范围内，超出线性范围的则用乙腈(4.2)进行适当的稀释后再进样分析。炔雌醚标准工作溶液的高效液相色谱图参见附录A8结果计算试样中炔雌醚的含量X,以质量分数表示，单位为毫克每千克(mg/kg),按式(1)计算。农业部2483号公告一1一2016X-CXVXV:V3Xm(1)式中：C一试样中炔雌醚峰面积对应的浓度，单位为微克每毫升(ug/mL)；V试样中加入提取液的体积，单位为毫升(mL);V,一上机前最终定容体积，单位为毫升(mL):V3加入固相萃取柱中提取液的体积，单位为毫升(mL):试样的质量，单位为克(g)测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。9重复性一-RLOEARCH CE在重复性条件下获得的4这2个测定值的算术平均值的20%。3