1、SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4637-2016地中海白蜗牛检疫鉴定方法Detection and identification of Cernuella virgata(Da Costa,1778)2016-08-23发布2017-03-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布科涂丽查真伪SN/T4637-2016地中海白蜗牛检疫鉴定方法1范围本标准规定了地中海白蜗牛Cernuella virgata(DaCosta,1778)的检疫鉴定方法。本标准适用于地中海白蜗牛的检疫鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的
2、版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T3067-2011软体动物常规检疫规范3术语与定义SN/T3067确定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1矢囊dart sack蜗牛生殖系统中一个藏有1枚中空的钙质或壳质骨针的肌肉质的囊。一般用长径与短径之比来描述矢囊的相对长度。3.2恋矢love dart矢囊中的骨针，为蜗牛交配时刺激器官，一般一个矢囊含有1枚恋矢，恋矢的质地和形状常用于分类。3.3盲管diverticulum受精囊柄分枝形成盲管，盲管的缺失与否是区别欧洲蜗牛科与湿螺科的主要鉴别特征。3.4COI基 cytochrome cox
3、idase subunit I线粒体细胞色素C氧化酶亚基I,该基因为DNA条形码鉴定靶标基因，常用于物种鉴定和系统发育关系研究。4地中海白蜗牛基本信息学名：Cernuella virgata（Da Costa,1778)异名：Cochlea virgata Da Costa,1778;Helicella virgata(Da Costa,1778);Helix variabilisDraparnaud,1801;Helix maritima Draparnaud,1805;Helix castroiana Servain,1880;Helix terrosaLocard,1899;Xeroph
4、ila euxina Clessin,1883。英文名：Common white snail,Mediterranean white snail,white snail,Vineyard snail,Striped snail,Zoned snail。lSN/T4637-2016分类地位：软体动物门Mollusca,腹足纲Gastropoda,肺螺亚纲Pulmonata,柄眼目 Stylomma-topgora,湿螺科 Hygromiidae,白蜗牛属Cernuella。地中海白蜗牛又称普通白蜗牛，主要近似种有忽视白蜗牛 Cernuella neglecta(Draparnaud,1805),
5、骏氏白蜗牛 Cernuella jonica(Mousson,1854)。地中海白蜗牛的其他信息参见附录A。5方法原理地中海白蜗牛主要通过运输工具、木质包装材料、花卉盆景和污染的农副产品远距离传播，污染的谷物和橘子是其最重要的传播媒介，由于这种蜗牛喜欢在麦子收获前成群结队地爬到快成熟的麦穗上休眠，收割和干燥作业并不能将休眠的蜗牛彻底杀灭，因而疫区谷物传播的几率是很高的。传播方式和途径是确定现场检疫方式的依据。贝壳形态、软体特征和COI基因序列是实验室鉴定的主要依据。6器具和试剂6.1器具体视显微镜、放大镜、手电筒、塑料自封袋、广口标本瓶、4mm孔径土壤筛、小铁铲、游标卡尺、白瓷盘、培养皿、镊子
6、、剪刀、显微镊子、显微剪刀、微针、解剖腊盘、标签、微型离心机、恒温金属浴、PCR仪、1.5mL离心管、0.2mLPCR反应管、移液器。6.2试剂75%乙醇、无水乙醇、硫酸镁、DNA提取试剂盒、PCRMaster Mix、ddH2O。7现场检疫对来自疫区（参见附录A)的麦船、谷物和橘子等农产品、木质包装材料、集装箱必须重点检查，仔细观察船舱、集装箱的底部和四角部位以及所装货物与木质包装材料是否有蜗牛，由于该螺的生态习性不同于其他蜗牛，喜欢在明亮的高处休眠，因此尤其要注意船仓、集装箱顶部的检查，发现任何蜗牛都应及时杀死或作熏蒸处理。对来自疫区的原木、盆景、苗木、水果等未经加工的植物性材料也应认真检
7、查，对可能被蜗牛污染的物品可用高压水枪冲洗检查或做预防性的熏蒸灭蜗处理。蜗牛爬行过后，都会留下银灰色的丝带状黏液痕迹，这是判定是否有蜗牛污染的重要依据。发现蜗牛标本，随时装入塑料自封袋或标本瓶带回实验室做进一步的检验鉴定。发现盆景等携带土壤或其他细碎衬垫材料时，需过筛检查是否有卵或幼螺。8实验室鉴定8.1测量、观察、解剖和饲养用游标卡尺测量蜗牛贝壳的壳高和壳宽、卵粒直径。用肉眼或放大镜或体视显微镜仔细观察卵和螺的形态特征。将闷杀（见10.1）处理后的标本，参照SN/T3067-2011中8.3.1进行软体解剖，分离出生殖系统。单独查获的卵粒，参照SN/T3067-2011中8.4方法，将其孵化
8、和饲养为成螺后，再做鉴定。2SN/T4637-20168.2Cernuella Schliter鉴征贝壳低矮陀螺形，有5个6个螺层，各螺层稍膨胀，贝壳白色、灰色或黄褐色，常有黄褐色的色带，色带常断续。壳口内侧常为棕色或黄褐色。胚螺层有放射状的细螺纹。壳口圆形，稍倾斜，多有白色、褐色或红褐色十分明显的内环肋，脐孔稍窄，可透视。鞭状体短，黏液腺管状。8.3地中海白牛 Cernuella virgata(Da Costa)鉴定特征8.3.1卵圆形，白色，直径1.5mm左右。8.3.2贝壳8.3.2.1成螺贝壳白色或微黄色，有时略带红色，通常在上部有2条褐色条带，下部有3条6条狭窄条带。有明显的圆锥形
9、螺旋部。一般有6个7个螺层，各螺层膨胀略成凸形，最后一个螺层（体螺层）圆形，其周缘圆滑。体螺层上有无数不规则排列的，从细到中等粗细的生长线，有些个体体螺层下部有螺纹。壳口一般为圆形，少数非常大的个体壳口为椭圆形，有中等厚度的内环肋。唇白色或略带红色，边缘稍外折，不反转。脐孔形状多变，但通常是开放的，不被轴缘遮盖。脐孔直径为壳宽的1/101/6，有时不位于中心。壳高6mm19mm,壳宽8mm25mm。(参见附录B中图B.1)8.3.2.2幼螺幼螺贝壳在外形上与成螺基本一致，壳质薄，易碎，壳口内侧无环唇肋。8.3.3螺体软体浅灰色，略带红色或淡黄色，背部黑色，有大的结节，外套膜红棕色，触角浅灰色，
10、透明，长约8mm。(参见图B.2)8.3.4生殖系统阴茎牵引肌短，阴茎本体长，通常是鞭状体的3倍4倍。输精管细长，约为阴茎本体的1.5倍。矢囊大，插入腔室内。粘液腺多，从副矢囊长出，四支，每支有分叉，中等长度，不卷曲。受精囊柄粗短，宽大，受精囊大。（参见图B.3)8.3.5COI基因片段序列鉴定按附录C方法提取DNA、PCR扩增和双向测序，将所测序列与Genbank登录号为KF927148已知地中海白蜗牛的COI基因序列进行比对，相似度一般应95%。9结果评定以贝壳形态为基本鉴定依据，螺体和生殖系统解剖形态为辅助鉴定特征，并注意与近似种鉴别（参见附录D),对于贝壳特征典型的个体符合8.3.2鉴定为地中海白蜗牛C.virgata(DaCosta,1778),对于贝壳特征有变异的个体，需同时符合8.3.2、8.3.3和8.3.4才能鉴定为地中海白蜗牛C.virgata(DaCosta,1778)。符合8.3.5作为前期初筛或形态鉴定结果的分子佐证。3