1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767,-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第8部 分:玉 米MON810品系Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part 8Maize MON810 14-013发布 14-08-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发布sN/T3767,8-2014亠刖口SN/T3767食品中转基因成分环介导等温扩增(LA
2、MP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt11品系;第4部分:玉 米Bt176品系;第5部分:玉 米GA21品系;第6 部分:玉 米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉 米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系;第1 2 部分:玉 米T-2 5 品系;第1 3 部分:玉米3 2 7 2 品系;第1 4 部分:玉米5 9 1
3、2 2 品系;第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 1 2 品系;第1 6 部分:大豆A 5 5 4 7 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 3 品系;第1 8 部分:大豆G T S 4 3 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第部分:水 稻Bt63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第部 分:水 稻L L R I C E 6 2 品系;第2 5 部分:水 稻M 1 2 品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:小麦B
4、 7 3-6 品系;第29部分:甜 菜H 1品系;第3 0 部分:油菜R T-7 3 品系。本部分为SN/T3767的第8部分。本部分按照GB/T1,1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人民共和 国珠海 出入境检验检疫局、中华人 民共和 国广东 出入境检验检疫局、中华人 民共和国北京 出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起 草人:王 小 玉、邝筱 珊、冯家望、刘津、李 志勇、胡松楠、游 淑珠、曾静、薛 峰、陈敬、刘李登、常彦磊。出口食品
5、中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第8部 分:玉 米MON810品系1 范围SN/T3767的本部分规定 了玉扩增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于玉米及其加工产本方法的定性检测低限为0.52 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是件。凡是不注 日期的引用文件,其GB/T6682 分析实验室用水G B/T 1 9 4 9 5.2 转基 因 产 品 检G B/T 1 9 4 9 5.3 转基 因 产 品 检 测GB/T19495.7 转基因产品检测SN/T2268 转基因植物晶系SN/T3767.2-2014 出口食MP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增
6、检测过程的4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取 纯化按照G B/T 1 9 4 9 5,3 的规定执行。6 LAMP检测方法6,1 原理6.1.1 一般原理根据转基因玉米MON810品系外源基因和玉米边界序列设计特异性 内引物和外引物各一对并添sN/T 3767.8-201410品系特异性的环介导等温的定性检测。,仅 注 日期 的版本适用于本文文件。核酸提取纯化和制样方成sN/T3767,8-2014加一对环引物,特 异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上 的六个独立区域,在 反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在B
7、s莎聚合酶 的作用下启动循环链置换反应,在 特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。在反应混合体系中不应存在DNA聚合酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下 限的情况下,定 性检测结果可清楚判断样 品是否为转基 因产品。6.1.2 显色液显色原理SYBR Green I是一种高灵敏 的DNA荧光染料,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟 内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的
8、8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色 由橙色变为绿色。6,2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6.2,2 水浴锅或加热模板:6 3.0 0,5 和8 0.0 0,5。6,2,3 离心管:0.1 m L、1,5 m L。6.2.4 移液器:量 程0.5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6.2.5 计时器。6,3 试剂和材料
9、 除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6,3.2 d N T P s 溶液:每 种核苷酸浓度1 0 m m o l/L。6.3.3 Bs莎DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果 的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。6.3,4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲液:含0 m m o l/L T o s H C l(p H 值为8,8)、1 0 0 m m o l/L 硫酸铵、1 0 0 m m o l/L 氯化钾、m m。l/L 硫酸镁、1%T o t o m X-1 0 0。6.3.5 硫酸镁溶液:1
10、 5 0 m m o l/L。6.3.6 甜菜碱:5 m l/I 。6,3,7 显色液:S Y B R G r e e n I 荧光染料,1 0 0 0。6,3.8 引物:根 据转基因玉米MON810品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2,环引物1和 环引物2。外引物扩增片段长度:192bp外引物扩增片段长度:228bp夕 卜 引 物1(F3,5-3):GGGCTACATCGAAGACAGC夕 卜 引 姥 勿2(B3,53):GCAAGCAAATTCGGAAATGA内 引 铭 勿1(FIP,5-3,):GCCAGAGGGAACCAGTACCG
11、ATTTACCTGATCCGCTACAA内 引 彬 勿2(BIP,5-3):AAGTGTGCCCACCACAGCGAAAGTCCTCGTTCAGGTC环引姥勿1(FLP,5-3):TTGACGGTCTCGTGCTTG环 引 牛 勿2(BLP,5-3):CACCACTTCTCCTTGGACAT2sN/T 3767.8-20146,4 实验步骤6.4,1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1,1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6,4.1.2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1,3 设两个空
12、 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6,4,2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表明从样品中提取 的DNA,可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基 因的检测参照 sN/T3767.214的规定进行。6,4.3 玉米MoN810品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖 内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。
13、表1 玉米MoN810品系 LAMP反应体系6.4,4 LAMP反应参数6 3.0 0.5 恒温扩增9 0 m i n,8 0,0 0.5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。组 分工作液浓度力 口 准 莘 廑 鳘/uL反应体系终浓度ThermPl缓冲液2.51夕 卜 引物1(F3)1 0 u m l/L0,2 u m 1/I 夕 卜 引物2(B3)10uml/Lo,2 u m l/I 冫内引物 1(F I P)40 pmol/,1.01,6umol/L内引物 2(BIP)40umol/L1.01,6uml/L环 引 物1(FLP20um1/L1.00,8umol/L环 引 物2(BLP)2
14、0 u m l/L1.00.8uml/LdNTPs10mml/L1,6mmol/L甜菜碱5mol/L40,8mmol/L硫酸镁150mml/L16mmol/LB s 莎D N A 聚合 酶8U/uLl0,32U/uLDNA模板100ng/uLB ne/pL水补足至 25,0sN/T3767,8-20146.4.5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6,5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6.5,2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。6
15、.5,3 阴性对照:反 应管 中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反 应管中液体呈7 结 果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙照结果正常,可 判断该样 品检测结果为 阴性。7.2 待检样品2个平行样反应管中,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样 品转基因玉米M O N 8 1 0 品系初筛阳按照SN/T2668进行实可对外引物PCR扩增产见附录A):8 结果 表 述8.1 检测结果为阴性,表 述为“该况进行结果判断和表述。8.2 检测结果为转基因玉米MsN/T3767.8-2014附 录 A(资 料性 附录)转基 因玉米MoN810品系基 因系列A.1 转基因玉米M o
16、 N 8 1 0 品系特异目标序列(来自A c c e s s i 1,n n o。A F 4 9 0 3 9 8.1)433GGC1CAT CGAAGAcAGC CAAGACCTCG AGATTTACCT GATCCGCTAC AACGCCAAGC491ACGAGACCGT CAAGCGCCCCCAGCCCGA551TCGGCAAGTG TGCCCACCTCGATGTG GGCTGCACCG611ACCTGAACGA GGTTGCA。2 引物碱基序 列及构成F3:GGCTACATCGAAGACB3:GCAAGCAAATTCGGF1cFIP:GCCAGAGGGAACCATACAB1cBIP:AAGTGTGCccACCACAGCAAAGAGGTCFIP:TTGACGGTCTCGTGBLP:CACCACTTCTCCTT寸冖0甲卜卜z厅Ns中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出 口食 品 中转 基 因成 分 环 介 导等 温 扩增(LAMP)检测 方 法第8部分:玉 米MON810品系sN/T3767。-2014中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲2号(10002