1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.1-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第18部分:大 豆 GTS4卜32品系Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticatlymodified components in food for export-Part 18 Soybean GTS40-3-214-O13发布 14-0B-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发布sN/T3767,182014口艹刖SN/T3767出口食品中转基因成
2、分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3 部分:玉 米B t-1 1 品系;第4部分:玉 米Bt176品系;第5部分:玉 米GA21品系;第6 部分:玉 米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉 米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:王 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系;第1 2 部分:玉 米T-2 5 品系;第1 3 部分:玉米3 2 7 2 品系;
3、第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 1 2 品系;第1 6 部分:大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 3 品系;第1 8 部分:大豆G T 3 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第部分:水 稻Bt-63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第24部分:水 稻LLRICE62品系;第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:
4、小麦B 7 3-6 1 品系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜R 73品系。本部分为SN/T3767的第18部分。本部分按照 GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。本部分起草单位:中 华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人 民共和国汕头出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国IsN/T3767.18-2014北京出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究 院
5、、仲恺农业工程学院、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:刘 津、蔡颖、凌莉、易敏英、高东微、谢力、曹际娟、冯家望、曾静、李 晓虹、陈颖、高苏娟、石磊、李志勇、张隽、陈源树、李婷、关丽军。sN/T3767.18-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第1 8 部分:大豆G T S 4 0 冖3 2 品系1 范围S N/T 3 7 6 7 的本 部 分 规 定 了食 品 中转 基 因大 豆 G T S 4 0 3-2 品系 特 异 性 的环 介 导 等 温 扩 增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于大豆及其加工性成分的定性检测。本方法的定性检测低限为0.52 规范
6、性引用文件下列文件对于本文件的应用是必期 的引用文仵,仅 注 日期 的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,其本文件。GB/T6682 分析实验室用水GB/T19495.2 转基 因 产 品GB/T19495.3 转基 因 产 品G B/T 1 9 4 9 5,5 转基 因 产 品 检 测G B/T 1 9 4 9 5,7 转基 因 产 品 检 测核酸定量PC和 制SN/T2668 转基因植物品系测方SN/T3767.2-2014 出口因MP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取纯
7、化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6,1.1 一般原理根据转基因大豆 GTS4032品系外源基 因和大豆边界序列设计 的内、外引物各一对,特 异性 目标sN/T3767.18-2014序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上 的六个独立 区域,利 用Bs莎酶启动循环链置换反应,在 大豆 GTS432品系特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构 的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 入显色液,即
8、可通过颜色变化观察判定结果。6,1.2 显色液显色原理SYBR Greell I是一种高灵敏的DNA荧光染料,可 以嵌入方式结合到双链DNA的小沟 内。当它与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时,SYBR染料分子的荧光信号不发生改变,颜 色显现为橙色;当 发生扩增反应时,随 着双链DNA的增加,SYBR染料 的荧光信号也随之大幅度增强,其 信号强度可代表双链DNA分子的数量,同 时颜色 由橙色变为绿色。6.2 仪器和设备6,2.1 超纯水发生器。6,2.2 水浴锅或加热模板:6 3.0 0.5 和8 0.0 0.5。6.2.3离心管:0.1mL、1.5m
9、L。6.2,4 移液器:量程0.5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6,2.5 计时器。6,3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6,3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6,3.2 d N T P s 溶液:每 种核苷酸浓度1 0 m m。l/L。6.3.3 Bs莎DNA聚合酶(如:NE百公司或具有同等效果的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。6.3.4 10TlaermlPol缓冲液:含0mml/L Tro-H(pH值8.8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L
10、氯化钾、mmol/L硫酸镁、1%Trkon 100。6,3.5 硫酸镁溶液:150mmol/L。6,3.6 甜菜碱:5mol/I。6.3.7 显色液:SYBR Green I荧光染料,1000。6.3,8 引物:根 据转基 因大豆 GTS43-2品系外源基 因和大豆边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2。外引物扩增片段长度:193bp夕 卜 引 物1(F3,5-3):GGAGTAGTACACTCACCAGT夕 卜 引 物2(B3,5-3):GCATTCGAGCTTCTTCAC内 弓u勿1(FIP,5,-3):ACAACGAGAAGCTATATGTAGATGCG
11、ACCCTAATAGGCAACAGC内 引 彬 勿2(BIP,5-3):CAAAACTATTTGGGATCGGAGAAGAGAACTTCTCGACGATGGC6,4 实验步骤6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1,1 阴性对照:采用不含有待测基因序列的植物基 因组DNA为模板。6,4,1.2 阳性对照:采用含有 目标基因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板,浓 度应略高于方法检测低限。2sN/T3767.18-20146.4,1,3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6,4.2 内源
12、基因检测LAMP检测前应先进行 内源基 因检测,结 果 阳性则表明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基因的检测参照SN/T3767.214的规定进行。6.4.3 大豆GTs40-32品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加入反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表 1 大 豆 GTs40-3-2品系LAMP反应体系6,4.4 LAMP反应参数6 3.0 0,5 恒温扩增6 0 m i n,8 0
13、,0 0.5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。6.4,5 显色反应反应结束后,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,立 即在黑色背景下进行颜色观察。6.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6.5.2 空白对照:反 应管 中液体呈橙色。6.5,3 阴性对照:反 应管中液体呈橙色。组 分工作液浓度力 口 样量/uL反应体系终浓度T h e r m o P l 缓冲液1外侧上游引物(F3)10uml/L0,2 u m o l/L外侧下游引物(B3)10uml/L0,2umol/L内侧上游引
14、物(FIP)40 pmol/L1,01.6 u m l/L内侧下游引物(BIP)4 0 u m o l/L1,01.6umol/LdNTPs10mmol/L1,6nmol/L甜菜碱5mol/L0.8ml/L硫酸镁150mmol/L16mmol/LB s 砂 D N A 聚合 酶8U/uL10.3 2 U/u LDNA模板100ng/uLB nc/pL水补足至 25,o 4v 5.s 63767,18-2014阳性对照:反 应管中液体呈绿色。7 结 果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样品检测结果为阴性。7.2 待检样品2个平行样反应
15、管中液体至少1管呈绿色,同 时各种实验对照结果正常,可 判断该样品转基因大豆 GT泓 3-2品系初筛阳性,还 应通过下列方法之一进行确证(见 附录A):按照S N/T 2 6 6 8 进行实时荧光P C R 检测;按照GB/T19495,5进行可对外引物PCR扩增产8 结果表述8.1 检测结果为阴性,表 述为“该样品未检0 3 2 品系。8.2 检测结果为转基因大豆GTS40-31按照确证实验情况进行结果判断和表述。附 录 A(资 料性附录)转基因大豆 GTs40-3-2品系基因序列A。1 转基因大豆G T s 4 O-3-2 品系特异目标序列(来自A c c e s s i o n n o。
16、A J 3 0 8 5 1 5.1)719GG721AG1D今【1冂D今“C TCACC781AAA虍 (X冫叮 C G E841AAGAACTGTTTsN/T3767.18-2014扎屺屺屺屺G%吼A T C A GTCGAG九 绌3TTOGTGAAGAF2ATAGGCAACAGCB2CTCGACGATGGC901AGCTCGAATGCA。2 引物碱基序 列及构成F3:GGAGTAGTACAcTCB3:GCATTCGAGCTTCTTFIP:BIP:CAAAACTATTTGGGA寸一0丨乩一卜卜z402删删跚删删删删廿打HTs中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第18部分:大 豆 GTs40-s-2品系sN/T3767.182014中 国 标 准 出 版 社 出 版北 京 市朝 阳区和平 里西街 甲2号(100029)北 京 市西 城 区三里河 北街16号(100045)总编 室:(010)68533533网址w w w.s p C,n e t。c n中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开 本8 8 0 1 2 3 0 1/1 6