1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.24-2014出口食品中转基因成分环介导+iEfTTg(LAMP)TOU|friEffi 24 frFr)7FfH LLRICE62 ffi ALoop-mediated isothermal amplification detection method for geneticaltym o d i f i e dJ;Iil,;I JIH:;exp o r t-14-013发布14-0B-01实施中华人民共和国国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局发布sN/T 3767.24-2014亠曰亠刖SN/T3767出口食品中转基 因成分环
2、介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt11品系;第4部分:玉 米Bt176品系;第5 部分:玉 米G A 2 1 品系;第6 部分:玉 米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉 米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉 米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉 米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉 米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉 米M O N 8 9 0 3 4 品系;第1 2 部分:玉 米T 2 5 品系;第13部分:玉 米3272品系;第1 4 部分
3、:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大豆A 2 7 0 4 1 2 品系;第1 6 部分:大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 3 品系;第1 8 部分:大 豆G T S 4 0-3-2 品系;第1 9 部分:大 豆 M O N 8 9 7 8 8 品系;第部分:水 稻Bt-63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第24部分:水 稻LLR E62品系;第2 5 部分:水 稻M 1 2 品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2
4、 8 部分:小麦B 7 3 6 1 品系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第部分。本标准按照GB/T1,109给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文仵的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 华人 民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究 院、中华人 民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人 民共和国广东出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。本部分主要起草人:贺 艳、刘伟、赵卫东、黄新、郑文杰、张裕君、陈颖、冯家望、李志勇、刘津、凌莉、石磊。sN/
5、T3767.24-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第2 4 部分:水 稻L L R I C E 6 2 品系1 范围SN/T3767的本部分规定 了稻谷和大米 中转基因水稻LLRICE62品系特异性的环介导等温扩增(LAMP)初筛检测方法。本部分适用于进出口的稻谷异性的定性检测。本方法的定性检测低限为0.52 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必日期 的引用文件,仅 注 日期 的版本适用于本文件。凡是不注 日期的引用文件,其GB/T6682 分析实验室用水GB/T19495,2 转基 因 产 品GB/T19495.3 转基 因 产 品GB/T19495.7
6、转基 因 产 品 检 测SN/T2584 水稻及其产品中SN/T3767.22014 出口食AMP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防 污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因水稻LLRICE62品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内引物、外引物和成环引物1本文件。抽样和制样sN/T3767.24-2014各一对,特 异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立区域,利用Bs莎
7、酶启动循环链置换反应,在 水稻 品系ILRICE62特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6,1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加人预先混合的钙黄绿素和锰离子,未 发生反应时锰离子与钙黄绿素结合,钙黄绿素的荧光被淬灭,呈 现橙色。当扩增反应发生时,扩 增过程中产生的焦磷酸根离子可与锰离子结合,形 成不可逆的沉淀物,将 锰离子从钙黄绿素上释放下来,从 而使钙黄绿素恢复荧光,同
8、时体系中的镁离子与钙黄绿素结合,进一步加强钙黄绿素的荧光,可 在365nm紫外光激发下散发 出约510nm的荧光,颜 色也 由橙色转为绿色。6,2 仪器和设备6.2.1 超纯水发生器。6,2.2 水浴锅或加热模板:63.00.5和80.00.5。6.2,3 离 心管:0.1 m L、1,5 m L。6.2.4 移液器:量 程0.5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L。6.2,5 计时器。6.3 试剂和材料除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6,3,1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.
9、2 d N T P s 溶 液:每 种核苷酸浓度1 0 m m o l/L。6,3.3 B踮DNA聚合酶:酶 浓度8U/uL,建议采用NEB的 Bs莎酶,或 者具有同等效力的酶。6.3,4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲液:含0 m m o l/L T o s H C l(p H 值为8,8)、1 0 0 m m o l/I 硫酸铵、1 0 0 m m o l/L 氯化钾、m m o l/L 硫酸镁、1%T t o n 1 0 0。6.3.5 硫 酸镁溶液:5 0 m m o l/L。6,3.6 甜菜碱:5 m o l/L。6.3.7 显 色液:钙 黄绿素荧光染料,0.3
10、 1 2 m o l/L。6.3.8 引物:根 据转基因水稻LLRICE62品系外源基 因和水稻边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1(F3),外引物2(B3),内引物1(P)、内引物2(BIP)和环引物1(FLP)、环引物2(BIP)。外引物扩增片段长度为226bp,序列信息见附录A。内 弓u吻1(FIP,5,-3):AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGAAACCAGGTGGACTAAAAGT内 引 4勿2(BIP,5-3):GCGAAAGGGGGATGTGCTGTGACTGGGAAAACCCTG环引匆勿1(FLP,5-3):CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC环 引 牛
11、勿2(BLP,5-3):GCCCGCACCGATTATTTATG夕卜 引 砷 勿1(F3,53):TGTAACACGCACACTCAC夕卜 引 物2(B3,5-3):CTGGCCGTCGTTTTACAA6.4 实验步骤6,4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6,4,1.1 阴性对照:2sN/T3767.24-2014采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4,1,2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板。6.4.1.3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6.4,2 内源
12、基因检测为降低检测成本、避免无效操作,进 行LAMP检测应先进行 内源基因检测,检 测结果 阳性表明从样品中提取出适宜进行LAMP检测的DNA,可以进行外源基因检测;否 则表明未能从样品中提取适宜进行LAMP检测的DNA,应重新进行DNA提取和纯化。内源基 因的检测参照SN/T3767.214的规定进行。6,4.3 水稻LLRICE62品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样 品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将 1uL显色液滴在管盖 内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表1 水稻LLRICE62品
13、系LAMP反应体系6.4.4 LAMP反应参数6 3,0 o.5 恒温扩增6 0 m i n,8 0.0 0.5 5 m i n 使酶灭活,反应结束。6.4.5 显色反应反应结束后,立 即将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀,在 黑色背景下进行颜色观察。组 分工作液浓度力 口 样量/uL反应体系终浓度T h e r m l P l 缓冲液2.5l环 引 物1(FLP)10uhol/L1,00,4 u m d/L环 引 物2(BLP)10uml/L0,4 u m o l/L夕 卜 引物1(F3)1 0 u m l/L0,50,2 u m l/L夕 卜 引杉 口2(B3)10uml/L0,50.2 p
14、mol/L内引物1(FIP)40umol/L1.6umol/L内引物2(BIP)40umol/L1,6 u m o l/LdNTPs10mmol/L1,6mmol/I甜菜碱5mol/L0.8mmol/L硫酸镁150mml/L16mmol/LB s 莎D N A 聚合酶8U/uL10,32U/uLDNA模板100 ng/pL28ng/uL水5.5sN/T3767.24-20146,5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6.5.2 空白对照:反 应管中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反 应
15、管中液体呈橙色。6,5,4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管果为阴性。7,2 待检样品2个平行样反应管结果正常,可 判断该样 品检测结验对照结果正常,可 判断该样 品转基因水稻LLRE62品系初筛阳性,还 应通过下证(见 附录A):按 照SN/T2584进行实 时荧光PC可用外引物PCR扩增产物进见附录A。8 结果表述8.1 对LAMP检测结果为阴性水 稻L L R I C E 6 2 品系。品,应 按照确证实验情况进行结8.2 对LAMP检测结果为转基因水稻LLRICE62品性的样果判 断和表述。sN/T3767.24-2014附 录 A(资
16、 料性附录)转基因水稻LLRICE62品系基因序列A,1 转基因水稻LLRICE62品系外源基因和水稻边界序列(来 自Accession nc,JQ4068811)TGTAACACGC ACACTCACCT ACTTCCAAAG ATTTAGCGAT GTCTTACTGCTAACGGGTGC ATCGACTA AAAGTATAAATAATCGGTGC GGGTGCTGCAAGG CGACGA AAGGGGGATGCC CAGTCACGACGTTGTAAAAC GAA。2 引物碱基序 列及构成FIP:5-AGCTGGCGTAATB1cAAAAGT-3BIP:5-GCGAAAGGGGGAFLP:5-CAAGGCGATTAAGBLP:5-GCCCGCACCGATTAF3:5-TGTAACACGCACAB3:5-CTGGCCGTCG151101151201寸一0寺卜zHHHHHHHHTs中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食品 中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第2 4 部分:水 稻L L R I C E 6 2 品系sN/T3767,242014中 国 标 准 出 版