1、SN/T 4419.8-2016出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第8部分：澳洲坚果1范围SN/T4419的本部分规定了食品中过敏原澳洲坚果成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法。本部分适用于食品及其原料中过敏原澳洲坚果成分定性检测。本部分所规定方法的最低检测限(LOD)为0.5%（质量分数）。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语、定义和缩略语
2、3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1过敏原allergen又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原。3.1.2澳洲坚果macadamia nu澳洲坚果又名昆士兰栗、澳洲胡桃、昆士兰果、夏威夷果等，是山龙眼科澳洲坚果属植物Macadamia ternifolia的可食用种仁。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate):脱氧核苷三磷酸LAMP(loop-mediated isothermal amplification):环介导等温扩增Triton X-100:聚乙二醇基基醚4防污染措施环介导等温扩增检测
3、过程的防污染措施应符合GB/T27403-2008中附录D的规定。5方法提要样品经研磨后，提取DNA,以DNA为模板，采用澳洲坚果AMP2豌豆球蛋白基因特异性检测引物1SN/T4419.8-2016进行LAMP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在过敏原澳洲坚果成分。6LAMP检测方法6.1原理根据澳洲坚果AMP2豌豆球蛋白基因序列设计特异性内引物、外引物和环引物各一对，特异性识别靶序列上的6个独立区域，在链置换型BstDNA聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在特异靶序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中
4、的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。显色液显色原理：SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌入方式结合到双链DNA的小沟内。当它与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的8001000倍。在不发生扩增反应时，SYBRGreenI染料分子的荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。6.2仪器和设备6.2.1水浴锅或加热模板：631和801。6.2.2离心管：0.1mL、1.5mL。6.2.
5、3计时器。6.2.4移液枪：量程0.5 L10L、量程10L100L、量程100 L1000 L。6.3试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2 CTAB 冲液(20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/LNa2EDTA,pH 8.0)。6.3.3 CTAB沉淀液(5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl)。6.3.4 NaCl溶液：1.2 mmol/L。6.3.5蛋白酶K(20mg/mL)。6.3.6dNTPs溶液：每种核浓度10mmol/L。6.3.7 Bst DNA聚合：浓度8 U/L。6.3.8 10ThermolPol缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8)、100 mmol/L硫酸铵、100 mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。6.3.9硫酸镁溶液：50mmol/L。6.3.10甜菜碱：5mol/L。6.3.11色液：SYBR GreenI荧光，1000。6.3.12引物：根据澳洲坚果AMP2豌豆球蛋白基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3,内引物FIP/BIP,环引物FLP/BLP,见表1。2