1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52252019进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快 速检测方法 多重 PCR 法Multiplex PCR for rapid identification of diarrheogenic Escherichia coli in food Multiplex PCR method2019-12-27 发布2020-07-01 实施中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布ICS W ISN/T 52252019前 言本标准依照 GB/T 1.12009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提
2、出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国郑州海关、解放军疾病预防控制中心、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国福州海关。本标准主要起草人:苗丽、王永亮、张灿、李阳、王俊杰、张秀平、党志浩、李轲、冯家旺、郑晶。1SN/T 52252019进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法多重 PCR 法1范围本标准规定了进出口食品中肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC），肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC，又称产志贺毒素大肠埃希氏菌），肠产毒性大肠埃希氏菌（ETEC），肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC），肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法。本标准适用于各
3、种进出口食品及其原料，有专门规定检验方法的除外。其它产品可参考使用本 标准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB 19489 实验室生物安全通用要求GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1多重聚合酶链式反应（MPCR）Multiplex Polymerase Chain Reaction 又称多重引物 PCR 或复合 PCR，它是在同一 PC
4、R 反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的 PCR 反应，其反应原理是模板基因序列先经高温变性成为单链，在 DNA 聚合酶作用和适宜的反应条件下，根据模板序列设计的两条引物分别与模板 DNA 两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合，接着在 DNA 聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP）为底物，使引物得以延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。3.2致泻大肠埃希氏菌 Diarrheogenic Escherichia coli致泻大肠埃希氏菌是一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌，同时也是一种可经过污染食物引起人类发病的致病菌
5、。根据毒力因子、致病机制、流行病学特征，主要将致泻大肠埃希氏菌分为 5 类：肠致病性大肠埃希氏菌（enteropathogenic E.coli，EPEC），肠出血性大肠埃希氏菌（enterohemorrhagic E.coli，EHEC，又称产志贺毒素大肠埃希氏菌），肠产毒性大肠埃希氏菌（enteroinvasive E.coli，ETEC），肠侵袭性大肠埃希氏菌（enteroinvasive E.coli，EIEC），肠集聚粘附性性大肠埃希氏菌（enteroaggregative E.coli，EAEC）。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DEC 致泻大肠埃希氏菌 Diarrheogenic
6、 Escherichia coli2SN/T 52252019EPEC 肠致病性大肠埃希氏菌 Enteropathogenic Escherichia coliEIEC 肠侵袭性大肠埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichia coliETEC 产肠毒素大肠埃希氏菌 Enteroinvasive Escherichia coliEHEC 肠出血性大肠埃希氏菌 Enterohemorrhagic Escherichia coliEAEC 肠集聚粘附性性大肠埃希氏菌 Enteroaggregative Escherichia coliescV 蛋白分泌物调节基因 gene enc
7、oding LEE-encoded type III secretion system factorbfpB 束状菌毛 B 基因 bundle-forming pilus Bstx1A 志贺毒素 I 基因 Shiga toxin onestx2A 志贺毒素 II 基因 Shiga toxin twoelt 热不稳定性肠毒素基因 heat-labile enterotoxininvE 侵袭性质粒调节基因 invasive plasmid regulatorastA 集聚热稳定性毒素 A 基因 enteroaggregative heat-stable enterotoxin AestIa 猪源热
8、稳定性肠毒素基因 heat-stable enterotoxins initially discovered in the isolates from pigs estIb 人源热稳定性肠毒素基因 heat-stable enterotoxins initially discovered in the isolates from human aggR 集聚粘附菌毛调节基因 aggregative adhesive fimbriae regulatorpic 肠定植因子基因 protein involved in intestinal colonization eae 紧密素基因 gene en
9、coding intimin for Escherichia coli attaching and effacing ipaH 侵袭性质粒抗原 H 基因 nvasive plasmid antigen H-genePCR 聚合酶链式反应 polymerase chain reactiondNTP 脱氧核糖三磷酸 deoxyribonucleoside triphosphate5方法提要本标准依据致泻性大肠埃希氏菌的致病机理，检测致病型 EPEC（bfpB、escV）、EIEC（invE）、ETEC（elt、estIa、estIb）、EHEC（escV、stx1A、stx2A）、EAEC（ast
10、A、aggR、pic），采用多重 PCR技术，根据 PCR 扩增产物的条带大小确定致泻性大肠埃希氏菌致病型别。6设备和材料6.1恒温培养箱，36 1，42 1。6.2均质器。6.3振荡器。6.4无菌均质杯或无菌均质袋；容量 500mL。6.5无菌培养皿；直径 90 mm。6.6一次性接种环。6.7移液器：量程分别为 1 mL、5 mL 和 10 mL，刻度为 0.1 mL。6.8微量移液器：0.5 L 2 L、2 L 20 L、20 L 200 L。6.9灭菌 PCR 反应管。6.10电子天平：感量 0.1 g、0.01 g。6.11恒温水浴箱：100。6.12冷冻离心机：控温 4 8，最大转
11、速不小于 13 000 r/min。6.13核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.14PCR 扩增仪。6.15核酸电泳仪，包括电源、电泳槽、制胶槽（长度 10 cm）和梳子。3SN/T 522520196.16凝胶成像系统。7 培养基和试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。7.1营养肉汤：见附录 A 中 A.1.1。7.2肠道菌增菌肉汤：见附录 A 中 A.1.2。7.3麦康凯琼脂（MAC）：见附录 A 中 A.1.3。7.4伊红美兰琼脂（EMB）：见附录 A 中 A.1.4。7.5TE 缓冲液：
12、见附录 A 中 A.1.5。7.610PCR 缓冲液：见附录 A 中 A.1.6。7.750TAE 缓冲液：见附录 A 中 A.1.7。8检验程序食品中五种致泻大肠埃希氏菌检验程序见图 1。图 1食品中五种致泻大肠埃希氏菌检验程序4SN/T 522520199操作步骤9.1样品制备、增菌培养和分离以无菌操作取检样 25 g（或 25 mL），加入装有灭菌 225 mL 营养肉汤的均质杯中，用旋转刀片式均质器以 8 000 r/min 10 000 r/min 均质 1 min2 min；或加入装有 225 mL 营养肉汤的均质袋中，用拍击式均质器均质 1 min2 min。液体样品震荡混匀即可
13、。于 36 1培养 6 h。取 10 L，接种于 30 mL 肠道菌增菌肉汤管内，于 42 1培养 18 h。将增菌液划线接种 MAC 和 EMB 琼脂平板，于 36 1培养 18 h24 h，观察菌落特征。在MAC 琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为砖红色，不分解乳糖的菌落为无色或者是淡粉色。在 EMB琼脂平板上，分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽，不分解乳糖的菌落为无色或者是淡粉色。9.2细菌模板 DNA 的制备9.2.1使用接种环挑取平板上可疑致泻性大肠埃希氏菌 10 个 20 个（10 个以下全选），挑取菌落时不但要挑取乳糖发酵的菌落，同时也要挑取乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落，
14、打散至盛有 1mL 0.85%灭菌生理盐水的 Eppendorf 管内，13 000 r/min 离心（4 8）2 min，弃上清液。9.2.2加入 50 L 100 L 1TE 缓冲液至 Eppendorf 管中，充分混匀。9.2.3100水浴或者金属浴维持 10 min，将 Eppendorf 管置于冰上冷却。9.2.413 000 r/min 离心 10 min，上清为 PCR 扩增模板，用于 PCR 扩增。9.2.5每次 PCR 反应使用 EPEC、EIEC、ETEC、EHEC、EAEC 标准菌株作为阳性对照。同时，使用大肠埃希氏菌 CICC 10003 或等效标准菌株作为阴性对照，以
15、灭菌去离子水作为空白对照，控制 PCR 体系污染。致泻大肠埃希氏菌特征性基因见表 1。也可使用商业化的 DNA 提取试剂盒并其按说明制备模板 DNA。9.3DNA 浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。DNA 的浓度按照公式(1)计算：c=AN50（1）式中：C DNA 浓度，单位为微克每毫升（g/mL）；A 260 nm 处吸光值；N 核酸稀释倍数；1 OD 260=50 g/mL 双链 DNA；OD 260/OD 280比值在 1.71.9 之间时，适于 PCR 扩增。9.4多重 PCR 扩增9.4.
16、1PCR 反应体系（25 L）：10PCR 反应缓冲液（含 Mg2+）3 L；2.5 mM dNTP Mixture 3 L;5 U/L Ex Taq DNA 聚合酶 0.4 L；10 mol/L 引物对各 2 L；50 ng/L 模板 DNA 2 L；水补足至25 L。9.4.2反应条件：预变性 95 4 min；变性 95 30 s；62 退火 30 s；延伸 72 1.5 min，30 个循环；72 延伸 5 min，4 保存反应产物。注：PCR 反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。5SN/T 522520199.5多重 PCR 扩增产物的电泳检测1TAE 电泳缓冲液制备 1.8%2%琼脂糖凝胶；55 60时加入溴化乙锭至终浓度为0.5 g/mL。取 8 L 15 L PCR 产物，分别和 2 L 6 上样缓冲液混匀后进行点样，用 DNA分子 Marker 作参照。5 V/cm 电压，电泳 20 min 40 min，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录并保存。9.6测序当电泳结果出现可疑阳性时，将 PCR 扩增产物进行 DNA 测序。10结果判定及表述10.1质量控