1、书 书 书犐 犆犛 犅 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 基因条形码筛查方法第 部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犻 狀 犵狊 犮 狉 犲 犲 狀 犻 狀 犵犿犲 狋 犺 狅 犱犘 犪 狉 狋：犙狌 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊 犲 狊 发布 实施中华人民共和国海关总署发 布书 书 书前言本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京海关、中华人民共和国厦门海关。本部分主要起草人：邓丛
2、良，陈红运、赵晓丽、吕玉峰、骆卫峰、刘兴亮、郑春生。犛犖犜 SN/T 4877基因条形码筛查方法分为15个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体；第4部分：检疫性茎点霉；第5部分：检疫性拟茎点霉；第6部分：检疫性嗜酸菌；第7部分：检疫性轮枝菌；第8部分：检疫性炭疽菌；第9部分：检疫性腥黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉；第11部分：检疫性异株苋亚属；第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒 ；第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒；第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒；第15部分：检疫性叶点霉。本部分为SN/T 4877的第14部分。基因条形码筛查方法第 部分：检
3、疫性南方菜豆花叶病毒属病毒范围本部分规定了检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒的基因条形码筛查方法中提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。本部分适用于植物繁殖材料及植物产品中检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒的筛查检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。南方菜豆花叶病毒检疫鉴定方法。藜草花叶病毒检疫鉴定方法。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。犇犖犃条形码（犇犖犃犫 犪 狉 犮 狅 犱 犲）条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短
4、的片段。南方菜豆花叶病毒属基本信息中文名称：南方菜豆花叶病毒属学名：犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊该属病毒可侵染单子叶植物和双子叶植物，但每个病毒的自然寄主范围相对窄，病害症状主要是花叶和斑驳。该属有 个种和个暂定种，该属病毒包括南方菜豆花叶病毒（犛 狅 狌 狋 犺 犲 狉 狀犫 犲 犪 狀犿狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊，）和藜草花叶病毒（犛 狅狑犫 犪 狀 犲犿狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊，）等种检疫性植物病毒。有关该病毒属的其他信息参见附录。原理南方菜豆花叶病毒属（犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊）的成员为正义单链病毒。病毒复制酶基因的保守区域即为该属的条形码
5、特征序列，根据此保守区域设计简并引物，进行 扩增和产物测序，实现对犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊病毒的筛查检测。犛犖犜 仪器和试剂 仪器与设施酶联检测仪、电子天平（感量 ）、定性仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等；微量移液器（，）；酶联板、研钵等；隔离温室。试剂试剂见附录。制样挑取畸形、不成熟的种子播于灭菌土中，待长出 片真叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（株为组）并编号。犇犖犃条形码筛查分别提取样品和对照的总，反转录合成后，进行扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染的植物组织作阳性对照，用无菌水作空白对照。具体操作见附录。结果判定 通
6、用 方法检测结果为阴性，则判定未检出南方菜豆花叶病毒属病毒。通用 方法检测结果为阳性，则进行序列测定与分析：）如果翻译后氨基酸序列与南方菜豆花叶病毒属已知病毒序列（参见附录）同源性大于，则判定检出南方菜豆花叶病毒属病毒（具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴定）。）如果翻译后氨基酸序列与南方菜豆花叶病毒属已知病毒序列同源性低于：如果系统发育分析表明与南方菜豆花叶病毒属病毒聚为一群，则判定检出南方菜豆花叶病毒属病毒（具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴定）；注：所检测到的病毒可能属于基因组序列尚未测定的已知病毒或尚未报道的新的病毒种类。如果系统发育分析表明与南方菜豆花叶病毒属病毒未聚为一群，则判定
7、未检出南方菜豆花叶病毒属病毒。）如果测定的基因组序列与南方菜豆花叶病毒属中的和 病毒同源性最高，则判定筛查出检疫性植物病毒，需要根据标准方法（和 ）进行最终鉴定。样品保存、结果记录与资料保存 结果记录与资料保存记录样品信息和检测数据，包括样品来源、植物种类、取样时间与地点，检测时间、方法和结果以及犛犖犜 人员签字。检测方法应保存电泳照片，测序结果保存测序报告图。样品保存检出南方菜豆花叶病毒属病毒样品应妥善保存在超低温冰箱中，或冻干后低温保存，并作好登记和标识，以备复核。犛犖犜 附录犃（资料性附录）南方菜豆花叶病毒属简介犃 病毒粒体形态南方菜豆花叶病毒属病毒毒粒子为等轴对称的二十面体（），无包膜
8、，直径约，有 个蛋白亚基，每个蛋白亚基有两个区域一个形成二十面体外壳约 厚的部分，另一个在病毒内形成部分顺序的“臂”。犃 基因组特性所有犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊病毒的基因组均为条多顺反子、正义、单链，由个开放阅读框架（，）组成：、和都是由基因组翻译产生的，其中 是通过渗漏扫描机制而表达的；通过 核糖体移码机制，与 形成个融合蛋白；是由亚基因组翻译产生的。编码复制酶的模体位于内。犃 病毒种类蓝莓带化病毒（犅 犾 狌 犲 犫 犲 狉 狉 狔狊 犺 狅 犲 狊 狋 狉 犻 狀犵狏 犻 狉 狌 狊，）鸭茅斑驳病毒（犆狅 犮 犽 狊 犳 狅 狅 狋犿狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊，）
9、白茅黄斑驳病毒（犐犿狆 犲 狉 犪 狋 犪狔 犲 犾 犾 狅狑犿狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊，）紫花苜蓿暂时性线条病毒（犔狌 犮 犲 狉 狀 犲狋 狉 犪 狀 狊 犻 犲 狀 狋狊 狋 狉 犲 犪 犽狏 犻 狉 狌 狊，）水稻黄斑驳病毒（犚 犻 犮 犲狔 犲 犾 犾 狅狑犿狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊，）黑麦草斑驳病毒（犚狔 犲 犵 狉 犪 狊 狊犿狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊，）田菁花叶病毒（犛 犲 狊 犫 犪 狀 犻 犪犿狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊，）节花茄斑驳病毒（犛 狅 犾 犪 狀 狌犿狀 狅 犱 犻 犳 犾 狅 狉 狌犿犿狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉
10、 狌 狊，）南方菜豆花叶病毒（犛 狅 狌 狋 犺 犲 狉 狀犫 犲 犪 狀犿狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊，）南方豇豆花叶病毒（犛 狅 狌 狋 犺 犲 狉 狀犮 狅狑狆 犲 犪犿狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊，）藜草花叶病毒（犛 狅狑犫 犪 狀 犲犿狅 狊 犪 犻 犮狏 犻 狉 狌 狊，）犛犖犜 地三叶草斑驳病毒（犛狌 犫 狋 犲 狉 狉 犪 狀 犲 犪 狀犮 犾 狅 狏 犲 狉犿狅 狋 狋 犾 犲狏 犻 狉 狌 狊，）芜菁丛簇病毒（犜狌 狉 狀 犻 狆狉 狅 狊 犲 狋 狋 犲狏 犻 狉 狌 狊，）绒毛烟斑驳病毒（犞犲 犾 狏 犲 狋狋 狅 犫 犪 犮 犮 狅犿狅 狋 狋 犾 犲
11、狏 犻 狉 狌 狊，）犃 寄主范围犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊病毒即可侵染双子叶植物，也可侵染单子叶植物。然而，种病毒的自然寄主范围是很窄的。唯一的例外是藜草花叶病毒（），该病毒可侵染几个科的植物。植物侵染犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊病毒后，叶片上通常会出现花叶或斑驳症状。犃 传播方式所有犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊病毒都容易通过机械传播，多种病毒也可通过甲虫传播。蓝莓带化病毒（）通过蚜虫传播，绒毛烟斑驳病毒（）通过盲蝽蟓传播。一些病毒还可通过种子传播，例如南方菜豆花叶病毒（）、南方豇豆花叶病毒（）和藜草花叶病毒（）。犛犖犜 附录犅（规范性附录）犚犜 犘犆犚检测犅
12、 试剂犅 犜 狉 犻 狕 狅犔裂解液犅 三氯甲烷犅 异丙醇犅 乙醇犅 去离子水（犇犈犘犆处理）犅 犜犃犈 冰醋酸 加去离子水定容至。用时加水稀释至。犅 加样缓冲液 溴酚蓝（）蔗糖水溶液犅 实验步骤犅 总犚犖犃提取称取 植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的 离心管中，加入的 试剂，剧烈震荡摇匀后室温保持；，离心 ，取上清；加入 三氯甲烷并剧烈振荡混匀；，离心 ，取上清；加 倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温保持；，离心 ，弃上清；加 的乙醇洗涤沉淀，离心，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于 去离子水（处理）中，保存备用。也可采用等效的试剂盒提取总。犅 犚犜 犘犆犚反应 检测引物见表。合成
13、反应体系：在 反应管中加入总，下游引物 （），去离子水，水浴，取出后立即放在冰上，加入 ，水浴，然后再加入 ，混匀后 水浴 ，水浴 ，合成。和 犛犖犜 的用量需要依据反转录酶的品牌进行调整。也可采用一步法 试剂盒进行扩增。表犅 引物序列引物名称序列（）扩增片段 约 注：，；，；，反应体系见表。表犅 犘犆犚反应体系组分体积（）去离子水 （）（）上游引物（）下游引物（）犜犪 狇酶（）总反应体积 反应参数：；，个循环；。也可采用一步法 试剂盒进行扩增。犅 电泳犅 制备凝胶配制（）的琼脂糖凝胶。溴化乙锭可直接加入琼脂糖凝胶中（浓度为），也可在电泳完成后使用溴化乙锭染色。犅 电泳用加样缓冲液与样品混合，然后将其和适合的分子量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。犅 结果判定犅 阳性对照出现约 的扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待检样品出现与阳性对照一致的扩增条带，判定检出犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊病毒。犅 阳性对照出现约 的扩增条带，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待检样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定未检出犛 狅 犫 犲犿狅 狏 犻 狉 狌 狊病毒。注：如有必要，可进一步测序验证。犛犖犜 附录犆（资料性附录）检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒基因参考序列 （）（）犛犖犜