1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5227.1020192019-12-27 发布2020-07-01 实施中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布ICS 67.120.10X04出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）Rapid detection of marten derived ingredient in food for exportRecombinase-aid amplification(RAA)method第10部分：出口食品中貂源性成分快速检测.indd 12020/1/16 21:52:34第10部分：出口食品中貂源性成分快速
2、检测.indd 22020/1/16 21:52:34ISN/T 5227.102019前 言SN/T XXXXXXXX出口食品中动物源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA法）预计分为以下部分：第 1 部分：出口食品中鸡源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 2 部分：出口食品中猪源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 3 部分：出口食品中羊源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 4 部分：出口食品中鸭源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 5 部分：出口食品中牛源性成分快速检测 重组
3、酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 6 部分：出口食品中水牛源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 7 部分：出口食品中马源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 8 部分：出口食品中驴源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 9 部分：出口食品中狐狸源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 10 部分：出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）；第 11 部分：出口食品中大鼠源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）。本部分为 SN/T XXXXXXXX
4、 第 10 部分。本部分是根据 GB/T 1.12009 给出的规则起草。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国郑州海关、中华人民共和国成都海关、中华人民共和国拱北海关、中华人民共和国合肥海关、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京海关、中华人民共和国大连海关、中华人民共和国厦门海关、杭州众测生物科技有限公司。本部分主要起草人：苗丽、林华、罗宝正、陈静、宗凯、王娉、汪琳、郑秋月、徐淑菲、孔繁德、程奇。第10部分：出口食品中貂源性成分快速检测.indd 12020/1/16 21:52:34第10部分：出口食品中貂源性成分快速检测.indd 22020/1/
5、16 21:52:341SN/T 5227.102019出口食品中貂源性成分快速检测 重组酶介导链替换核酸扩增法（RAA 法）1 范围SN/T 52272019 的本部分规定了出口食品中貂源性成分的 RAA 检测方法。本部分适用于出口食品中貂源性成分的定性检测。2 规范性引用文件本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.1%（W/W）。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 274032008 实验室质量控制规范 食品
6、分子生物学检测3 术语和定义、缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.1 貂 Martes食肉目，裂脚亚目，鼬科，鼬亚科，貂属。常见的有以下几种：美洲貂、黄喉貂（青鼬）、石貂（榉貂）、松貂（林貂）、日本貂、渔貂、紫貂（黑貂）。我国产石貂、紫貂、渔貂、黄喉貂四种。3.1.2 实时荧光 RAA real-time RAA一种重组酶介导链替换的恒温核酸快速扩增技术（简称 RAA 技术）。利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在恒温下（一般为 37 42），该重组酶可与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，在单链 DNA 结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA 的双链结构，当引物在模板 DNA
7、上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在 DNA 聚合酶的作用下，形成新的 DNA 互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记，随着 RAA 反应的进行，RAA 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。3.1.3 Ct 值 cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3.1.4 T 值 time threshold每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所需要的时间。第10部分：出口食品中貂源性成分快速检测.indd 12020/1/16 21:52:342SN/T 5227.1020193.2缩略语下列缩略语适用于本文件。BS-recA：枯草芽孢杆菌重组酶（Bac
8、illus subtilis recombinase）。Bsu：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammonium bromide）。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）。dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）。EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diaminetetraacetic acid）。RAA：重组酶介导扩增（recombinase-aid amplification）。SC-recA：天蓝色链霉菌重组酶（Streptomy
9、ces coelicolor recombinase）。SSB：单链 DNA 结合蛋白（single stranded DNA binding protein）。Tricine：N-三羟甲基甲基氨基酸（N-tris Hydroxymethyl methylglycine）。Tris：三羟甲基氨基甲烷 tris（Hydroxymethyl）aminomethane。4 方法提要以提取的 DNA 为模板，采用貂的特异性检测引物和探针进行实时荧光 RAA 扩增，根据实时荧光RAA 的增幅情况，实现对食品和饲料中貂成分的检测鉴定。5 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合
10、GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无 DNA 酶污染的容器分装。表 1 检测用引物和探针物种名称引物/探针序列（5 3）扩增片段长度靶基因貂F：ATTCTCACCTGACCTGTTAGGAGACCCAGAC269bp线粒体细胞色素b 基因（Cytb）R：TAAGGAGATCAGCTACTAGTAATCAGAACAAGCP：ACTTCCTATTCGCATATGCTATCCTACGAFAM-dTCTHFABQH-dTCCCTAATAAACTAG-C3spacer 注：目的基因序列参见附录 A。F 为上游引物，R 为下游引物，P 为探针，FAM-dT，THF，BQH-dT 和 C3spacer
11、均为探针修饰基团。5.1 CTAB 提取缓冲液（pH8.0）：10 g/L CTAB，0.7 mol/L NaCl，0.05 mol/L Tris-HCl，0.01 mol/L Na2EDTA。5.2 酚：氯仿：异戊醇=25：24：1。5.3 异丙醇。5.4 70%乙醇（体积比）。5.5 TE 缓冲液（pH8.0）：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。第10部分：出口食品中貂源性成分快速检测.indd 22020/1/16 21:52:343SN/T 5227.1020195.6 缓冲液 A：20%聚乙二醇。5.7 实时荧光 RAA 扩
12、增体系：2.5 mmol/L dNTPs，225 ng/L SSB，300 ng/L recA 重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA），75 ng/L Bsu DNA 聚合酶，75 ng/L Exo 核酸外切酶，250 mmol/L Tricine，12.5 mmol/L 二硫苏糖醇，250 ng/L 肌酸激酶。也可以使用等效的商品化的试剂盒代替。5.8 缓冲液 B：280 mol/L 醋酸镁。6 仪器设备6.1实时荧光 PCR 仪。6.2恒温荧光检测仪。6.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6.4恒温水浴锅。6.5离心机：转速大于等于 12 000 r/min。6.6微量移液器：量程
13、0.5 L10 L，10 L100 L，20 L200 L，200 L1000 L。6.7研钵及粉碎装置。6.8涡旋振荡器。6.9离心管：2mL、1.5mL。7 检测步骤7.1 DNA 提取取 0.2 g 粉碎或磨碎的样品至一洁净的 1.5 mL 离心管中（6.9）（若样品含杂质和调味品，可加入1 mLdd H2O 洗涤两次），加入 600 L CTAB 提取缓冲液（pH 8.0）（5.1），涡旋振荡混匀后于 70 温育 15 min，期间颠倒离心管 23 次；12 000 r/min 离心 5 min，取上清液于一新的干净 1.5 mL 离心管中；加入 500 L 酚：氯仿：异戊醇（25：2
14、4：1）（5.2），上下颠倒离心管 23 次后涡旋振荡混匀，12 000 r/min 离心 5 min；转移上层水相至一新的 1.5 mL 离心管中，加入 0.7 倍体积异丙醇（5.3），上下颠倒离心管 23 次，4 静置 30 min，4 下 12 000 r/min 离心 3 min，小心弃去上清液；加入 700 L 70%乙醇（5.4），重悬沉淀，12 000 r/min 离心 1 min，小心弃去上清液；打开管盖，室温挥发干液体，加入 50 L100 L TE 缓冲液（pH8.0）（5.5）溶解 DNA，-20 保存备用。DNA 提取也可采用等效DNA 提取试剂盒进行。7.2 DNA
15、浓度和纯度的测定使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260和 A280。DNA的浓度按照式（1）计算：c=AN50/1000 （1）式中：cDNA 浓度，单位为微克每微升（g/L）；A260 nm 处的吸光值；N核酸稀释倍数。当 A260/A280比值在 1.71.9 之间时，适宜于 RAA 扩增。第10部分：出口食品中貂源性成分快速检测.indd 32020/1/16 21:52:344SN/T 5227.1020197.3 实时荧光 RAA 扩增7.3.1 实时荧光 RAA 反应总体系见表 2。表 2 实时荧光 RAA 反应总体系试剂体
16、积/L实时荧光 RAA 扩增体系（5.7）20缓冲液 A（5.6）12.5正向引物(10 mol/L)2.0反向引物(10 mol/L)2.0探针(10 mol/L)0.6DNA 模板（5 ng/L）2.0缓冲液 B（5.8）2.5加 ddH2O 至507.3.2 实时荧光 RAA 反应程序7.3.2.1 实时荧光 PCR 仪39，60 s，1 个循环；39，30 s，40 个循环，在每次循环时收集荧光。7.3.2.2 恒温荧光检测仪39，1 min；39，20 min，第二阶段开始收集荧光。7.3.3 实验对照检测过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用含有貂源成分的样品作为阳性对照样品，不含貂源成分的样品作为阴性对照样品，以与模板等体积的双蒸水作为空白对照样品。8 质量控制8.1 实时荧光 PCR 仪8.1.1 空白对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。8.1.2 阴性对照：无荧光对数增长，相应的无报告 Ct 值。8.1.3 阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的 Ct 值小于等于 30.0。8.2 恒温荧光检测仪8.2.1 空白对照：无荧光对