1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 52812020禽坦布苏病毒病检疫技术规范Quarantine protocol for avian Tembusu virus infection2020-12-30 发布2021-07-01 实施ICS 1.220CCS B 41中华人民共和国海关总署发 布中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 24 千字2021 年 6 月第一版 2021 年 6 月第一次印刷印数 1500书号：1551752 定价 16.00 元禽坦布苏病毒病检疫技术规范行 业 标 准SN/T52812020*北京市朝阳区东四环南
2、路甲 1 号（100023）编辑部：（010）65194242-7509中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址 52812020I前 言本文件是根据 GB/T1.12020 给出的规则起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、福建省农科院畜牧兽医研究所、中华人民共和国南京海关、东莞市中鼎检测技术有限公司、厦门市翰均科检测科技有限公司、中华人民共和国青岛海关。本文件主要起草人：郑腾、万春和、王凯民、张体银、黄瑜、林杰、程龙飞、张险朋、傅光华、曹维强、施少华、张志灯、陈红梅、王武军、傅秋玲、陈美传、陈国强、白泉阳、李宋钰、徐彪
3、、徐超。1SN/T 52812020禽坦布苏病毒病检疫技术规范1 范围本文件规定禽坦布苏病毒病的临床诊断和反转录-聚合酶链式反应鉴定技术。本文件适用于禽坦布苏病毒病的临床诊断和实验室检疫。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语、定义和缩略语本文件没有需要界定的术语和定义。以下缩略语适用于本文件。RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（Reversetranscriptionpolyme
4、rasechainreaction）DEPC 焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate）DNA 脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleosidetriphosphate）EB 溴化乙锭（Ethidiumbromide）PBS 磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）RNA 核糖核酸（Ribonucleicacid）TAE三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethylaminomethane-boricacid-ethylenediaminetetraaceticacid）
5、4 临床诊断4.1 发病症状当禽（尤其是种禽、蛋禽）出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：体温急剧升高，采食量骤降；双脚无力，共济失调或（和）双翅下垂；产蛋率骤降；种禽、蛋禽还会出现开产种（蛋）禽产蛋率上升慢，持续低产蛋率，无产蛋高峰或（和）产蛋率时高时低，后备种（蛋）禽开产推迟或（和）产蛋不整齐。4.2 病理变化当禽（尤其是蛋禽）出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一：种禽、蛋禽卵巢（卵泡）出血；种禽、蛋禽卵泡内卵黄液化，卵泡变形；种禽、蛋禽腹腔内积有淡红色血水或淡黄色浑浊液体；种禽、蛋禽卵巢（卵泡）萎缩，卵泡数量减少。肉禽肝脏局灶性出血或（和）脑组织轻度出血。2SN
6、/T 528120204.3 临床诊断当禽（包括后备种禽、蛋禽）出现以上病症，结合剖检病变，可初步诊断为疑似禽坦布苏病毒病，需要进一步进行实验室确诊。5 样品采集根据临床症状和剖检病理变化情况，无菌采集疑似发病的禽、濒死禽或死亡禽（尤其是种禽、蛋禽）的卵巢、肝脏样品，采集的样品在冷藏条件下 24h 内送达实验室检测。6 实验室诊断6.1 设备6.1.1 组织匀浆器。6.1.2 高速台式冷冻离心机。6.1.3 微量移液器。6.1.4 PCR 仪。6.1.5 电泳仪。6.1.6 电泳槽。6.1.7 紫外凝胶成像系统。6.2 试剂6.2.1 水，应符合 GB/T6682 所规定一级水的要求。6.2.
7、2 磷酸盐缓冲液（PBS），配制方法见附录 A.1。6.2.3 RNA 提取试剂 Trizol。6.2.4 三氯甲烷。6.2.5 异丙醇。6.2.6 DEPC 水，配制方法见附录 A.2。6.2.7 75%乙醇，配制方法见附录 A.3。6.2.8 反转录酶。6.2.9 TaqDNA 聚合酶。6.2.10 RNA 酶抑制剂。6.2.11 脱氧核苷酸三磷酸 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP）。6.2.12 引物（Primer）：20moL/L。根据禽坦布苏病毒的非结构蛋白 NS5 基因保守区序列设计，扩增长度为 469bp，序列中含有简并碱基 Y=C/T。上游引物 F：5-C
8、TAYCAYGGAAGYTACGAAGT-3下游引物 R：5-CTTTTCTCGCTTYCCCATCAT-36.2.13 溴化乙锭溶液，配制方法见附录 A.4。6.2.14 1TAE 缓冲液，配制方法见附录 A.5。6.2.15 1.0%琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A.6。6.2.16 10 加样缓冲液，配制方法见附录 A.7。6.2.17 DNA 相对分子质量标准物 DL2000DNAMarker。6.2.18 DNA 纯化回收试剂盒。3SN/T 528120206.3 样品处理将采集的样品或组织经剪碎处理后，与磷酸盐缓冲液按照体积比 1：4 的比例制成组织匀浆液，反复冻融 3 次，8000
9、r/min 离心 30min，取上清液冻存分装备用。6.4 RNA 提取6.4.1 以灭活的禽坦布苏病毒为阳性对照；以其他灭活禽源 RNA 病毒（如鸭型肝炎病毒）为阴性对照；以 DEPC 水为空白对照。对照样品与待检样品同步操作进行提取 RNA。6.4.2 在经 DEPC 水处理的 1.5mL 灭菌离心管中，分别加入 250L 组织匀浆上清液或对照样品，再加入 750LRNA 提取试剂 Trizol，充分混匀 15s。加入 200L 预冷的三氯甲烷，充分混匀，室温静置 10min。6.4.3 4下 12000r/min 离心 15min 后，小心吸取上清液 600L，加入经 DEPC 水处理的
10、 1.5mL 灭菌离心管中，再加入 600L 经-20预冷的异丙醇，颠倒混匀。6.4.4 4下12000r/min离心15min后，轻轻倾倒掉上清液，分别加入800L的75%乙醇清洗2次，倒置于吸水纸上 5min，室温晾干。6.4.5 加入 20LDEPC 水，轻轻混匀，溶解离心管壁上的 RNA，2000r/min 离心 30s。提取的 RNA应在 2h 内进行 RT-PCR 扩增或保存于-20冰箱备用。6.4.6 RNA 的提取也可采用市售等效的商品化核酸 RNA 提取试剂盒，按照说明书的要求进行操作。6.5 RT-PCR 扩增6.5.1 RT-PCR 反应体系为 50L，每个反应管依次加入
11、 20LDEPC 水、5L 的10OneStepRNAPCRBuffer、10L 的 MgCl2(浓度为 25mol/L)、5L 的 dNTPMixture(浓度为 10mol/L)、1L 的 RNA酶抑制剂(浓度为 40U/L)、1L 的反转录酶 AMV(浓度为 5U/L)、1L 的 Taq 酶(浓度为 5U/L)、1L 的上游引物 F(浓度为 20moL/L)、1L 的下游引物 R(浓度为 20moL/L)、5L 提取核酸 RNA。混匀后 2000r/min 离心 15s，使反应混合液都沉降到管底。6.5.2 将上述反应混合液按照以下步骤进行一步法 RT-PCR 扩增：第一步是反转录，42
12、反转录 30min；第二步 PCR 循环，94预变性 5min 后进入 PCR 循环，循环参数为 94变性 50s、54退火30s、72延伸 35s，循环 30 次；第三步 72延伸 7min。6.5.3 RT-PCR 的扩增也可采用等效的市售商品化的 RT-PCR 检测试剂盒，按照说明书的要求进行操作。6.6 琼脂糖凝胶电泳用 1TAE 电泳缓冲液配制 1.0%的琼脂糖凝胶。将凝胶放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将 5LRT-PCR 产物与 0.5L10 加样缓冲液混合混匀后加入样品孔。在电泳时使用 DNA相对分子质量标准物 DL2000DNAMarker 作对照。5V/cm 电泳
13、约 0.5h 后在凝胶成像分析系统观察结果。6.7 测序用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约 469bp 的DNA 片段，应对其切胶回收后进行测序，测序结果和参考序列进行核苷酸同源性比较。6.8 结果判定经核酸扩增电泳后，阳性对照会出现一条大小约 469bp 特异性条带（参见附录 B.1 中 2 号泳道），4SN/T 52812020而阴性对照和空白对照均没有该扩增条带（参见附录 B.1 中 3 号和 4 号泳道）。待检样品经核酸扩增电泳后，在阳性对照相应位置上有条带并经测序验证，测序结果和参考序列（参见附录 C.1）的核苷酸同源性在 95%以上方可判为阳
14、性。无条带或条带的大小不是约 469bp 或有约 469bp 条带但测序结果和参考序列的核苷酸同源性在 95%以下的为阴性。7 综合判定7.1 经 RT-PCR 扩增出 469bp 片段并经测序判为阳性，且存在相应的发病症状和病理变化，可确诊为禽坦布苏病毒病。7.2 经 RT-PCR 扩增出 469bp 片段并经测序判为阳性，无相应的发病症状和病理变化，可确诊为禽坦布苏病毒感染。5SN/T 52812020附 录 A（规范性）试剂的配制A.1 0.01 mol/L PBS 的配制NaCl 8.0gKCl0.2gNa2HPO412H2O2.9gKH2PO4 0.2g将上述试剂溶于 800mL 水
15、中，定容至 1000mL，121高压灭菌 30min，4保存备用。A.2 DEPC 水的配制按 0.1%的浓度在水中加入 DEPC，室温静置过夜，121高压灭菌 30min，冷却备用。A.3 75%乙醇的配制750 mL 的无水乙醇加入 250mL 水中，-20保存备用。A.4 EB 溶液的配制20 mg 的溴化乙锭加入 20mL 水中。A.5 1TAE 电泳缓冲液的配制A.5.1 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH 8.0）的配制二水乙二铵四乙酸二钠18.61g氢氧化钠调 pH 至 8.0加水至 100mL。A.5.2 50TAE 电泳缓冲液的配制羟基甲基氨基甲烷（T
16、ris）242g冰乙酸57.1mL0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL加水至 1000mL，使用时用水稀释 50 倍。A.5.3 1TAE 电泳缓冲液的配制50TAE 电泳缓冲液20mL加水至 1000mL。6SN/T 52812020A.6 1.0%琼脂糖凝胶的配制琼脂糖 1.0g加入 1TAE 电泳缓冲液至 100mL。置微波炉中加热至完全融化，待冷至 50 60时，加溴化乙锭（EB）溶液 5L，摇匀后倒入制胶板中，待完全凝固后取下加样梳，备用。A.7 10 加样缓冲液聚蔗糖25g溴酚蓝0.1g二甲苯青0.1g加水至 100mL。SN/T 52812020附 录 B（资料性）电泳图B.1 禽坦布苏病毒 RT-PCR 检测结果电泳图（GenBank 序列号：KP096415.1）图 B.1 禽坦布苏病毒 RT-PCR 检测结果电泳图1DNA 相对分子质量标准物 DL2000DNAMarker；2阳对照；3阴性对照；4空白对照；5阳性样品；6阴性样品。SN/T 52812020附 录 C（资料性）参考序列C.1 禽坦布苏病毒非结构蛋白 NS5 基因保守区序列（