1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 6食品安全国家标准食品添加剂 乳酸链球菌素2 0 1 6-0 8-3 1发布2 0 1 7-0 1-0 1实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 61 食品安全国家标准食品添加剂 乳酸链球菌素1 范围本标准适用于经乳酸乳球菌(L a c t o c o c c u s l a c t i ss u b s pl a c t i s)发酵后提取而制得的食品添加剂乳酸链球菌素。2 分子式、结构式和相对分子质量2.1 分子式C1 4 3H2 3 0O3 7N4 2
2、S7(N i s i nA)C1 4 1H2 2 8O3 8N4 1S7(N i s i nZ)2.2 结构式N i s nA:第2 7位氨基酸为组氨酸(H i s);N i s nZ:第2 7位氨基酸为天冬酰胺(A s n)2.3 相对分子质量N i s i nA:3 3 5 4.3 5(按2 0 1 3年国际相对原子质量)N i s i nZ:3 3 3 0.3 1(按2 0 1 3年国际相对原子质量)3 技术要求3.1 感官要求感官要求应符合表1的规定。G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 62 表1 感官要求项目要求检验方法色泽浅棕色至乳白色状态粉末将适量试样均匀置于白瓷盘内,在
3、自然光线下观察其色泽和状态3.2 理化指标理化指标应符合表2的规定。表2 理化指标项 目指 标检验方法效价/(I U/m g)9 0 0附录A中的A.3干燥减量,w/%3.0G B5 0 0 9.3氯化钠,w/%5 0.0G B/T5 0 0 9.4 2铅(P b)/(m g/k g)1.0G B5 0 0 9.7 5 注:商品化的乳酸链球菌素产品应以符合本标准的乳酸链球菌素为原料,可添加氯化钠、乳固体等辅料而制成,其效价符合声称。3.3 微生物指标微生物指标应符合表3的规定。表3 微生物指标项 目指 标检验方法菌落总数/(C F U/g)1 0G B4 7 8 9.2大肠菌群/(MP N/g
4、)3.0G B4 7 8 9.3大肠埃希氏菌/(MP N/g)3.0G B4 7 8 9.3 8沙门氏菌不得检出G B4 7 8 9.4G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 63 附 录 A检 验 方 法A.1 一般规定本标准除另有规定外,所用试剂的纯度应为分析纯,所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品,应按G B/T6 0 1、G B/T6 0 2、G B/T6 0 3的规定制备,试验用水应符合G B/T6 6 8 2中三级水的规定。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时,均指水溶液。A.2 鉴别试验A.2.1 试剂和材料A.2.1.1 盐酸溶液:0.0 2m o l/L。A
5、.2.1.2 氢氧化钠溶液:5m o l/L。A.2.1.3 脱脂牛奶:脂肪含量1%。A.2.1.4 石蕊牛奶培养基。A.2.1.5 检测菌:乳酸乳球菌(AT C C 1 1 4 5 4,N C I MB8 5 8 6)。A.2.2 分析步骤A.2.2.1 试样储备液制备取1g试样,溶于1L盐酸溶液中,溶液效价约为10 0 0I U/m L。A.2.2.2 对酸溶液的稳定性试验用盐酸溶液将试样储备液稀释至约5 0I U/m L,制成试样溶液。将该试样溶液煮沸5m i n,按效价测定方法测煮沸过的试样溶液中N i s i n效价。计算煮沸过的试样中N i s i n的效价,计算结果在其效价值的(
6、1 0 0%5%)内,表明无显著活性损失。A.2.2.3 对碱溶液的稳定性试验用盐酸溶液将试样储备液稀释至约5 0I U/m L,制成试样溶液。将该试样溶液煮沸5m i n,用氢氧化钠溶液调p H至1 1.0将溶液加热到6 5保持3 0m i n,冷却。然后滴加盐酸调p H至2.0,用效价测定方法测定最终溶液中N i s i n的效价。在按照上述操作处理后会出现抑菌活性的几乎完全损失。A.2.2.4 不同抑菌物质中N i s i n的鉴别A.2.2.4.1 乳酸乳球菌的培养:乳酸乳球菌(工作菌株)(AT C C 1 1 4 5 4,N C I MB8 5 8 6)在无菌脱脂牛奶中培养,3 0培
7、养1 8h。A.2.2.4.2 准备1个或多个装有1 0 0m L石蕊牛奶培养基的长颈烧瓶,在1 2 1灭菌1 5m i n,将0.1g试样加入该无菌的石蕊牛奶培养基中混匀,在室温下静置2h后加入0.1m L检测菌,3 0 下培养2 4h。A.2.2.4.3 检测菌(乳酸乳球菌)可在该效价的试样(约10 0 0I U/m L)中生长,但不能在相似浓度的其他抑菌物质中生长。G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 64 A.3 效价的测定A.3.1 试剂和材料A.3.1.1 乳酸链球菌素标准品(效价:11 06I U/g)。A.3.1.2 盐酸溶液:0.0 2m o l/L。A.3.1.3 吐
8、温溶液:吐温2 0水=11。A.3.1.4 培养基(S1):胰蛋白胨0.8%;酵母膏0.5%;葡萄糖0.5%;氯化钠0.5%;磷酸氢二钠0.2%;琼脂粉1.2%1.5%,灭菌后p H6.87.0。A.3.1.5 检测菌:黄色微球菌(N C I B 8 1 6 6)。A.3.2 分析步骤A.3.2.1 检测菌(N C I B 8 1 6 6)的培养及菌悬液的制备A.3.2.1.1 检测菌的培养用无菌接种环从甘油管或冻干管中取一环检测菌(N C I B 8 1 6 6),接种在无菌的S1平皿上,进行自然分离,挑出饱满、边缘光滑的菌落,扩大,接在S1的试管斜面上,在3 0恒温箱中培养2 4h,放入2
9、5冰箱中。A.3.2.1.2 菌株悬浮液的制备取在冰箱中的检测菌(N C I B 8 1 6 6),用无菌生理盐水洗脱下来,制成1 08C F U/m L浓度的细胞悬液,备用。A.3.2.2 平板的制备配制S1培养基2 0 0m L(按比例先把琼脂溶化,依次加入各组分溶解,磷酸氢二钠溶解后加入),经1 2 1、2 0m i n灭菌后,放冷至7 0左右,加入4m L吐温2 0溶液,充分摇匀,等冷却到5 05 5左右,加入已制备好的菌株悬浮液适量,使培养基中检测菌的最终浓度为1.01 06个/m L,摇匀,倒入水平放置的已灭菌的平板中,等完全凝固后,用直径为7mm打孔器,在平板上打出所需的孔数,小
10、心挖掉孔内琼脂,移入洁净工作台中吹风1.5h3.0h(吹风时间按空气中的湿度大小而定,同时控制室内温度最低,尽量不要让检测菌生长),吹干后,置25冰箱中,到次日使用。A.3.2.3 标准品溶液的制备准确称取乳酸链球菌素标准品(精确到0.0 0 01g),溶于盐酸溶液中,使最终浓度为2m g/m L(20 0 0I U/m L),摇匀,用盐酸稀释成3 0 0倍、6 0 0倍,即成高、低剂量标准溶液。A.3.2.4 试样溶液的制备称取一定量的试样(精确到0.0 0 01g),用盐酸溶液溶解后,稀释成高、低剂量试样溶液,其乳酸链球菌素含量,按估计单位高、低剂量与标准品溶液大致相当。A.3.2.5 滴
11、加溶液取出存放在冰箱中的平板,用移液器,取7 0L8 0L标准品高剂量溶液,随机滴加在平板的孔中,滴6个孔,再取7 0L8 0L标准品低剂量溶液,随机滴加在与高剂量溶液同一平板其余孔的6个G B1 8 8 6.2 3 12 0 1 65 孔中。试样溶液和标准品溶液滴在同一平板上,其操作同标准品。A.3.2.6 恒温培养等孔内的溶液渗透完全后,移入3 0恒温箱中培养1 6h2 4h后,测量抑菌圈直径。A.3.3 结果计算用卡尺测量抑菌圈直径,取其平均值,按式(A.1)计算效价:CS H=CB Hk(XS H+XS L)-(XB H+XB L)(XS H+XB H)-(XS L+XB L)(A.1)式中:CS H 试样溶液的效价,单位为国际单位每毫克(I U/m g);CB H 标准溶液的效价,单位为国际单位每毫克(I U/m g);XS H 高剂量试样溶液所致的抑菌圈直径,单位为毫米(mm);XS L 低剂量试样溶液所致的抑菌圈直径,单位为毫米(mm);XB H 高剂量标准溶液所致的抑菌圈直径,单位为毫米(mm);XB L 低剂量标准溶液所致的抑菌圈直径,单位为毫米(mm);k 高剂量与低剂量浓度的比值。若试样估计值不在测定值的9 0%1 1 0%范围内,需重新估计试样效价,重测。