1、G B/T 1 7 9 9 9.4-1 9 9 9前言 本标准是在我国建立的琼脂扩散试验(A G P)的基础上，并参照美国S P A F A S 公司A G P操作规程编制而成。S P F鸡微生物学质量控制国家系列标准，包括S P F鸡微生物学监测总则和9 种S P F鸡微生物学检测方法。本标准为 S P F鸡琼脂扩散试验。S P F鸡微生物学检测方法还包括以下部分:G B/T 1 7 9 9 9.1-1 9 9 9 S P F 鸡 红细胞凝集抑制试验;G B/T 1 7 9 9 9.2-1 9 9 9 S P F鸡 血清中和试验;G B/T 1 7 9 9 9.3-1 9 9 9 S P F
2、 鸡 血清平板凝集试验;G B/T 1 7 9 9 9.5-1 9 9 9 S P F 鸡 酶联免疫吸附试验;G B/T 1 7 9 9 9.6-1 9 9 9 S P F 鸡 胚敏感试验;G B/T 1 7 9 9 9.7-1 9 9 9 S P F 鸡 鸡白 痢沙门氏菌检验;G B/T 1 7 9 9 9.8-1 9 9 9 S P F 鸡 试管凝集试验;G B/T 1 7 9 9 9.9-1 9 9 9 S P F 鸡 间接免疫荧光试验。本标准由中华人民共和国农业部、国家科学技术部提出。本标准由农业部畜牧兽医司归口。本标准起草单位:农业部实验动物研究中心、山东省农科院家禽研究所。本标准主
3、要起草人:赵立红、陈德威、张秀美、靳彦华、秦卓明。中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 7 9 9 9.4 一1 9 9 9S P F鸡琼脂扩散试验S P F c h i c k e n-A g a r g e l p r e c i p i t a t i o n t e s t范围 本标准规定了琼脂扩散试验所用试剂、材料，操作程序及结果判定等。本标准适用于S P F鸡感染以下病毒后的沉淀抗体的监测:禽流感病毒A型(A v i a n I n f l u e z a V i r u sT y p e A)、传染性支气管炎病毒(I n f e c t i o u s B r
4、o n c h i t is V i r u s)、传染性法氏囊病病毒(I n f e c t i o u s B u r s a lD i s e a s e V i r u s)、传染性喉气管炎病毒(I n f e c t i o u s L a r y n g o t r a c h e i t i s V i r u s),禽痘病毒(F o w l P o xV i r u s)、马立克氏病病毒(Ma r e k s D i s e a s e V i r u s)、禽脑脊髓炎病毒(A v i a n E n c e p h a l o m y e l i t i s V i r u
5、s),网状内 皮增生症病毒(R e t i c u l o e n d o t h e l i o s i s V i r u s)、禽呼肠孤病毒(病毒性关节炎)(A v i a n R e o v i r u s),禽腺病毒 I 群(A v i a n A d e n o v i r u s G r o u p I)、多杀性巴氏杆菌(P a s t e-1 1 a m u l t o c i d a)2 原理 琼脂扩散试验是 一 种沉淀反应互相结合，在最适比例处出现沉淀线伉原、抗体在含有电解质的琼脂凝胶中，可以向四周自由扩散，二者。常采用已知抗原检测相应的沉淀抗体.3 试剂和材料3.1 试剂
6、3.1.1 琼扩抗原。31.2 阳性血清。3.1.3 被检血清。3.1.4 0.0 1 M,p H 7.2,8%氯化钠磷酸缓冲液。3.1.5 优质琼脂粉或琼脂糖。3.2 材料I2 门琼扩板。3.2.2 打孔器12.3 移液器。4 操作程序4.1 琼脂板制备 1 g 优质琼脂粉或0.8 g 一I g 琼脂糖加人1 0 0 m l,O.0 l M,p H 7.2,8%氯化钠磷酸缓冲液中(检测禽流感病毒感染时，同0.O 1 m o l/L,p H 6.4 的8 0 0 氯化钠磷酸缓冲液配制琼脂)，水浴加热融化，稍凉(6 0 C-6 5 C)，倒入琼扩板内(厚度为3 m m)，待琼脂凝固后，4 冰箱保
7、存备用。4.2 打孔 用六角形打孔器在琼脂板上按 7 孔梅花图案打孔，孔径 3 mm-4 m m，孔距 3 m m 用8“针头挑出国家质量技术监瞥局1 9 9 9 一 1 1 一 1 0 批准2 0 0 0 一 0 4 一 0 1 实施G B/T 1 7 9 9 9.4-1 9 9 9孔内琼脂，挑出时从孔一 侧边缘插入针头，轻轻移动，等空气进入孔底后，再向上 挑出。4.3 封底 打孔完毕，封闭孔底 将板底部在酒精灯上烘烤，使底部琼脂微溶化即可，也可在琼脂孔底部与板接触处加少量溶化的1 0 0 琼脂或琼脂糖。4.4 加样 用移液器滴加抗原干中间孔，周围1,4 孔加阳性血清，其余孔加被检血清。加祥时应将孔加满，不应出现凹形面，也不应溢出4.5 感作 将琼扩板加盖保湿，放于3 7 C 温箱内作用2 4 h-7 2 h，观察沉淀线5 结果判定5 门阳性 阳性血清与杭原孔之间有明显沉淀线时，被检血清与抗原孔之间也形成沉淀线，并与阳性血清的沉淀线末端吻合，则被检血清判为阳性。5.2 弱阳性 被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯，此被检血清判为弱阳性(需重复试验)5.3 阴性 被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，且阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阴性