1、中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准谷物及其制品中脱氧雪腐镰刀菌 烯醇的测定方法G B/T 1 4 9 2 9.5 一 9 4Me t h o d f o r d e t e r mi n a t i o n o f d e o x y n i v a l e n o l i n c e r e a l a n d c e r e a l p r o d u c t s1 主题内容与适用范围 本标准规定了谷物及其制品(蛋糕、饼千、面包等)中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的薄层色谱测定法及免疫测定法(E L I S A)的基本要求。本标准适用于谷物(d、米、玉米、大麦等)及其制品 蛋糕、饼干、面包等)中
2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的测定。第一 法的最低 检出 浓度为0.1 m g/k g,第二法的最低检出浓度为。1 n g/k g,第一篇薄层色谱测定法2 原理 谷物及其制品中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇经提取、净化、浓缩和硅胶G薄层展开后，加热薄层板。由于在制备薄层板时加入了三氯化铝，使脱氧雪腐镰刀菌烯醇在3 6 5 n m紫外光灯下显蓝色荧光，与标准比较。3 试剂以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。三氯甲烷。无水乙醇。甲醇。石油醚(6 0 _9 0 C 或3 0 -6 0 C).乙酸乙醋。乙睛。丙酮。异丙醇。乙醚。无水乙醚。氯化铝(A I C I _,6 H,O):化学纯。JI门1
3、，J月勺反J六匕7子OU八廿 :可.可.勺Jq曰，JqJ恤JIJ寸Jl口，J中性氧化铝:层析用，经 3 0 0 C 活化4 h,置千燥器中备用。活性炭:2 0 g活性炭，用 3 m o t/L盐酸溶液浸泡过夜、抽滤后，用热蒸馏水洗至无氯离子，在310洲312313中华人民共和国卫生部 1 9 9 4 一 0 1 一 2 4 批准1 9 9 4 一 0 8 一 0 1 实施G B/T 1 4 9 2 9.5 一 9 41 2 0 C 烘干备用。3 门4 硅胶(s薄层层析用。3.1 5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(以下简称D O N)标准溶液，精密称取5.0 m g D O N，加乙酸乙酷一 甲 醇(1
4、9 :1)溶解。转入1 0 m L容量瓶中，用乙酸乙醋一 甲 醇(1 9:1)稀释至刻度，此标准溶液含D O N O.5 m g/m l。吸 取此标准溶液。.5 m L，用乙酸乙醋一 甲醇(1 9:1)稀释至1 0 m L，此溶液每毫升含D O N 2 5 p g,4 仪器4.1 小型粉碎机。4.2 电动振荡器。4.3 7 5 m L玻璃蒸发皿。4.4 层析柱:内径2 c m，长 1 0 c m，不具活塞4.5 1 0 mL具塞浓缩瓶:底部具0.2 mL刻度尾管。4.6 玻璃板:5 X 2 0 c m,4.7 薄层涂布器:。.3 m m4.8 展开槽:N长2 5 c m，宽6 c m，高4 c
5、 m,4.9 紫外光灯:3 6 5 n m,4.1 0 微量注射器:1 0 ,L,5 0 p L,4.1 1 5 0 m l平底管。4.1 2 双波长薄层扫描仪:带数据处理机。5 分析步蕊5 门提取 称取2 0 g 粉碎样品置于2 0 0 m L 具塞锥瓶中，加8 m L水和1 0 0 m L 三氯甲 烷一 无水乙醇(8:2),密塞。在瓶塞上徐层水，盖严防漏，振荡1 h，通过折叠快速定性滤纸过滤，取2 5 m L滤液于7 5 m l _ 玻璃蒸发皿中，置 9 0 C水浴上通风挥干。5.2 净化5.2.1 液一 液分配5.2.1.1 谷物:用5 0 m l，石油醚分次溶解燕发皿中的残渣，洗入1
6、0 0 m L分液漏斗中，再用2 0 m L(玉米样品用3 0 m L)甲醇一 水(4:1)分次洗涤蒸发皿，转人同一分液漏斗中。52.1.2 谷物制品(蛋糕、饼干、面包等):用1 0 0 m L石油醚分次溶解蒸发皿中的残渣，洗入2 5 0 m L分液漏斗中，再用3 0 m L甲醉一 水(4 c”分次洗涤蒸发皿，转入同一分液漏斗中。振摇分液漏斗1.5 m i n，静置约1 5 m i n，使分层后，将下层甲醇一 水提取液过柱净化，不要将两相交界处的白色絮状物放入柱内。5.2.2 柱净化5.2.2.1 小麦及其制品:在层析柱下端与小管连结处塞约。.1 g 脱脂棉，尽量塞紧，先装入。.5 g 中 性
7、氧化铝，敲平表面，再加入。.4 9 活性炭.敲紧。将层析柱下端小管插入一橡皮塞，塞在抽滤瓶上，抽滤瓶中放一平底管接受过柱液，将抽滤瓶接上水泵或真空泵，稍稍开启泵，使活性炭压紧，将分液漏斗中的甲醇水提取液小心地沿管壁加入柱内，控制流速为每 1 5 s 1 8 -2 0 滴C m L/m i n)，甲醇一 水提取液过柱快完毕时，加入 1 0 m L甲醇一 水(4，1)淋洗柱，抽滤，直至柱内不再有液体流出。过柱速度控制在 2-3 m L/m i n，速度太快净化效果不好，太慢耗时太长。5.2.2.2 玉米:同5.2.2.1，只是将活性炭的用量改为0.3 g o5.3 制备薄层层析用样液 将过柱后的洗
8、脱液倒人7 5 m L玻璃蒸发皿中，用少量甲醇一 水(4，1)洗涤平底管。将蒸发皿置沸水G s/T 1 4 9 2 9.5 一9 4浴 L 浓缩至于。5.3.1 小麦:趁热加入3 m l，乙酸乙醋，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动蒸发皿数次，使充分沸腾将残渣中的D O N溶出，并将乙酸乙醋挥发至干，再加人3 m L乙酸乙酷同样处理一次，将溶剂挥干，最后加3 m 1乙酸乙醋，加热至沸，放冷至室温后转人浓缩瓶中，再用三份 1.5 m L乙酸乙醋洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。5.3.2 小麦制品、玉米:趁热加入3 mL乙酸乙醋，加热至沸，在水浴锅上轻轻地反复转动燕发皿数次，使充分沸腾，将残渣中D O
9、N溶出，放冷至室温后转入浓缩瓶中。加约。.5 m L甲醇一 丙酮(1:2)于蒸发皿中，用玻棒搅动溶解残渣，将蒸发皿置水浴锅上挥千溶剂后，加入3 m L乙酸乙醋，加热至沸，转动蒸发皿，使充分沸腾，放冷至室温后转入同一浓缩瓶中，再用0.5 m L甲醇一 丙酮(1:2)和 3 m L乙酸乙酷同样处理一次，乙酸乙酷提取液并人浓缩瓶中。将浓缩瓶置约9 5 水浴锅上，用蒸汽加热吹氮气浓缩至干，放冷至室温后加入。.2 m L三氯甲烷-乙睛(4:1)溶解残渣留作薄层层析用。5.4 M定5.4.1 薄层板的制备:4 g 硅胶G加约9 m L 1 5%氯化铝(A I C I,。6 H,0)水溶液，研磨约2 m i
10、 n 至呈粘稠状，铺成5 c mX2 0 c m的薄层板三块，置室温干燥后，于1 0 5 活化 1 h.贮干燥器中备用。5.4.2 点样:在每块薄层板上距下端2.5 c m的基线上点样。第一块板:对每一个样品先点第一块薄层板。在距板左边缘1.8 c m处点2 5 p L样液，在距板上端1.5 c m处的横线上并与基线样品点相对应的位置上点2 p L D O N标准液(5 0 n g),按5.4.3.1 条下横展薄层板，挥干溶剂后再在薄层板上距左边缘1 c m处的基线上点2 p L D O N标准液(5 0 n g),第二块板:在第一块板上未显荧光的样品则需在第二块薄层板上距左边缘0.8 -1
11、c m处滴加2 5 p L祥液，加1 川，标准液(2 5 n g)，在距左边缘2 c m处滴加1 K L标准液(2 5 n g)，在距右边缘1.2 c m处滴加2 川 标准液。对阳 性样品可进行概略定量:在薄层板上距左边缘0.8 -1 c m处滴加样液点(根据情况估计滴加点，或稀释后定量)，在距板左边缘2 c m处和在距右边缘 1.2 c m处分别滴加二个标准点，D O N的 量可为5 0 n g,7 5 n g,1 0 0 n g。再在距板上端1.5 c m处的 横线上点三个D O N标准点(各约5 0 n g)，使之与基线上的三个点相对应。5.4.3 展开 横展剂:乙醚、乙醚一 丙酮(9
12、5:5)或无水乙醚。任选其中一种，使样品D O N点偏离原点。7-1 c m,刚好与杂质荧光分开。纵展剂:三氯甲烷一 丙酮一 异丙醇(8，1，1)三氯甲 烷一 丙酮一 异丙醇一 水(7-5:1:1.5，。.1)5-4,3-1 横展:在展开槽内倒入1 0 m L横展剂。将点好样的薄层板靠样液点的长边斜浸入溶剂，展至板端过 工 2 m i n，取出通风挥干3 m i n。对小麦制品还须再用1 0 m L石油醚(3 0-6 0 C)横展一次，展至板端过 1 m i n，取出通风挥干5 m i n.5.4-3.2 纵横:在展开槽内倒入1 0 m L纵展剂。将横展挥干后的薄层板置展开槽内纵展1 5 c
13、m，取出通风挥干1 0 m i n。由于D O N与杂质分离的效果受空气湿度影响较大，当 板面分离效果不太好时即第一块薄层板的样品点附近有杂质荧光干扰时，可按极性大小依次换用以下几种展开方式:三氯甲烷一 丙酮一 异丙醇(8三氯甲烷一 丙酮一 异丙醉(8s 1:1).:1:1)并在展开槽盖内面贴上水饱和的滤纸。8.阮三氯甲烷一 丙酮一 异丙醇一 水(7三氯甲烷一 丙酮一 异丙醇一 水(7.5，1 1.5:0.1)a5:1:1.5:o.l 并在展开槽内面贴上水饱和的滤纸。改换纵展已止方式，展开第二块薄层板。如展开槽内极性太大，会使D O N点变偏。5.4.4 显荧光:先观察未加热的薄层板可见到显蓝
14、紫荧光的干扰点，这时D O N不显荧光，加热薄层板后，杂质点仍显荧光，它在D ON荧光点附近，但不千扰D O N。然后将此薄层板置 1 3 0 C 烘箱中加热 7G e/T 1 4 9 2 9.5 一9 41 0 m i n，取出放在冷的表面上，1 -5 m i n 后于3 6 5 n m紫外光灯下观察。5.4.5 观察与评定:薄层板经横展后，板上样液点的D O N移动约0.7 1 c m，正是根据这一点在纵展后使样品D O N点摆脱了杂质荧光的干扰。薄层板上端未经纵展的三个D O N标准点可分别作为横展后样品D O N点和二个标准D O N点的横向定位点，样品D O N点又可与纵展后的D O
15、 N标准点比较R,值而定性，这样从横向和纵向两个方面确定样品D O N点的位置，达到定性的目 的。两个标准D O N点的位置上均无杂质荧光干扰。如在第一块薄层板上祥液未显荧光，而在第二块薄层板上2 5 p L样液+2 5 n g 标准所显荧光强度与2 5 n g 标准D O N相等，则样品中D O N含量为阴性或。.0 5 m g/k g 以下。阳 性样品概略定量时，虽然薄层板上三个 D O N点在横展中都稍有移动，但对各点荧光强度无影响，二个标准点均可用于和样品D O N点比较荧光强度5.4.6 薄层光密度计测定:激发光波长 3 4 0 二、发射光波长4 0 0 二。在薄层板上标准D O N
16、荧光点至少在1 0 0 n g,2 0 0 n g,4 0 0 n g 时，测得的响应与D O N的量才呈线性关系。对D O N含量在0.3 m g/k g 以上的样品才用光密度计测定。当D O N含量在。.3 m g/k g 时点2 0 M L样液使测得的D O N量落在1 0。一2 0 0 n g 之间。用薄层光密度计测定时每块板上滴加二个标准D O N点，D O N标准点的量为1 0 0 n g,2 0 0 n g 或2 0 0 n g,4 0 0 n g，以 测得的峰 面积值为 纵坐 标，D O N的量为 横坐标，绘制标 准曲 线。54.了 计算 V,_入=A X=X 刀 X F21 0 0 0X 1 0 0 0 .。.(1)式中:X 样品中D O N的含量,m g/k g;A 薄层板上测得祥液点上D O N的量，K g:V,加人三氯甲 烷一 乙 睛 混合液 溶解残 渣的 体积，m L;V,-滴加样液的体积，m L;D 样液的总稀释倍数;m 三氯甲 烷一 乙睛混合液溶解残渣相当样品的质量，9。5.4.8 精密度:当 空白小麦中加入D O N量为。.3,0.5,1 m g/k g