1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B5 0 0 9.2 7 42 0 1 6食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定2 0 1 6-1 2-2 3发布2 0 1 7-0 6-2 3实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局发 布G B5 0 0 9.2 7 42 0 1 6 前 言 本标准代替S N/T3 0 3 82 0 1 1 出口海产品中西加毒素的检测 小鼠生物法 和S N/T3 8 6 92 0 1 4 出口水产品中雪卡毒素的测定。本标准与S N/T3 0 3 82 0 1 1和S N/T3 8 6 92 0 1 4相比,主要变化
2、如下:标准名称修改为“食品安全国家标准 水产品中西加毒素的测定”;保留小鼠生物法为第一法,增加液相色谱-串联质谱法为第二法。G B5 0 0 9.2 7 42 0 1 61 食品安全国家标准水产品中西加毒素的测定1 范围本标准规定了水产品中西加毒素的测定方法。本标准适用于水产品可食部分中西加毒素的测定。第一法 小鼠生物法2 原理用丙酮提取水产品中西加毒素,提取物经减压蒸干后,再以1%吐温-6 0生理盐水为分散介质,制备西加毒素-1%吐温-6 0生理盐水混悬液,将该混悬液注射入小鼠腹腔,观察小鼠存活情况,根据西加毒素致小鼠死亡时间和鼠单位的关系表查出对应的鼠单位,并按小鼠体重校正鼠单位,计算确定
3、西加毒素含量(鼠单位毒力)。3 试剂和材料除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。3.1 试剂3.1.1 吐温6 0(C6 4H1 2 6O2 6)。3.1.2 苦味酸HO-C6H2(NO2)3。3.1.3 丙酮(CH3C O CH3)。3.1.4 甲醇(CH3OH)。3.1.5 正己烷(C6H1 4)。3.1.6 乙醇(CH3CH2OH)。3.1.7 乙醚(CH3O CH3)。3.1.8 氯仿(CHC l3)。3.1.9 次氯酸钠(N a C l O)。3.1.1 0 生理盐水。3.2 试剂配制3.2.1 次氯酸钠溶液(5%):称取次氯酸钠5 0g,用99
4、 5 0m L水溶解,搅拌使次氯酸钠充分溶解。3.2.2 甲醇溶液(9 0%):量取1 0 0m L甲醇,加入9 0 0m L水,混匀。3.2.3 乙醇溶液(2 5%):量取2 5 0m L甲醇,加入7 5 0m L水,混匀。3.2.4 氯仿-甲醇溶液(3+9 7):将氯仿与甲醇按体积比为39 7混合均匀。3.2.5 1%吐温6 0-生理盐水:用生理盐水将吐温6 0稀释为吐温6 0含量为1%的溶液。G B5 0 0 9.2 7 42 0 1 62 3.3 标准品太平洋西加毒素-1(P-C T X-1,C6 0H8 8O1 9):纯度9 0%。3.4 材料小鼠:昆明系封闭群清洁级(C L)或无特
5、定病原菌级(S P F),且体重为1 8g 2 2g的健康雄性小鼠。4 仪器和设备4.1 电子天平:感量为0.0 0 1g。4.2 均质器。4.3 恒温水浴箱。4.4 旋转蒸发仪。4.5 氮气浓缩仪。5 分析步骤5.1 试样制备水产品取其可食部分(去骨),切成小块,制成肉糜。于-1 8以下保存。5.2 试样提取取试样2 0 0g置于塑料袋内,于7 0水浴1 5m i n。取出冷却后,加丙酮4 0 0m L,均质1 0m i n,用布氏漏斗抽滤并收集滤液。肉渣再重复萃取两次。合并滤液,于5 5 旋转蒸发浓缩至近干。加入1 0 0m L甲醇溶液(9 0%)溶解,转移至5 0 0m L分液漏斗中,再
6、加入1 0 0m L正己烷,充分振荡萃取,静置约3 0m i n以上,待分层完全,弃去上层正己烷层,收集下层甲醇溶液层。再加入1 0 0m L正己烷重复萃取一次。将下层的甲醇溶液于5 5旋转蒸发至干,以1 0 0m L乙醇溶液(2 5%)溶解,并转移至分液漏斗中,加入1 0 0m L乙醚充分振荡萃取,静置1 0m i n以上,待分层完全,收集上层乙醚层。下层溶液再用乙醚萃取两次。合并乙醚萃取液,于4 0旋转蒸发至近干。浓缩物用5m L氯仿-甲醇溶液(3+9 7)溶解并转移至刻度试管中,于4 5用氮气浓缩至干,用1%吐温6 0-生理盐水定容至2m L,充分振荡,制成均匀西加毒素-1%吐温6 0-
7、生理盐水混悬液。0.5m L该混悬液相当于5 0g试样。以此混悬液进行小鼠实验。注:为避免毒素的危害,应戴手套进行操作,用过的器材应在次氯酸钠溶液(5%)中浸泡1h以上,以使毒素分解。5.3 小鼠试验5.3.1 实验动物的饲养小鼠在通风、透光、清洁的室内环境饲养,实验期间正常供给标准啮齿类动物食物和饮水。5.3.2 小鼠试验将小鼠随机分为试验组、溶剂对照组、空白对照组3组,每组3只小鼠,每只小鼠称重(精确至0.5g),并记录体重。用染色法(如3%5%苦味酸溶液或其他染色剂)做好编号。5.3.2.1 试验组每只试验组小鼠腹腔注射0.5m L试样提取液。若注射时注射液溢出,须将该只小鼠弃去,并重新
8、G B5 0 0 9.2 7 42 0 1 63 注射一只小鼠。5.3.2.2 溶剂对照组每只溶剂对照组小鼠腹腔注射0.5m L1%吐温6 0-生理盐水,以排除吐温6 0-生理盐水可能产生的影响。5.3.2.3 空白对照组每只空白对照组小鼠不进行腹腔注射,与实验组和溶剂对照组的小鼠在相同的环境和条件下饲养。5.3.3 小鼠体征观察记录注射开始和完毕时间,仔细观察并记录小鼠停止呼吸时的死亡时间(到小鼠呼出最后一口气止)。小鼠中毒死亡症状:活动能力异常(减少至不活动)、步态异常(正常:慢走或快走,异常:兴奋的、不稳的)、腹泻、呼吸困难(急促浅的或喘息)、肤色青紫(主要在阴茎、耳、鼻、口、尾部)、竖
9、毛(轻至显著)、颤抖(阵发性或持续)、麻痹(阵发至后腿麻痹)、多涎(可能浸湿脸部和胸前毛)、直至挣扎跳跃最后死亡。小鼠在注射2h内要仔细观察,连续观察4 0 0m i n,当小鼠接近死亡时更要密切观察,准确记录死亡时间(直至小鼠呼出最后一口气止)。6 分析结果的表述6.1 试样中西加毒素毒力的计算观察从注射开始至4 0 0m i n小鼠的毒效应体征和存活情况,计算出一组3只小鼠中死亡2只以上的中位数死亡时间。根据中位数死亡时间,在表A.1中查出对应的MU。若小鼠体重小于或大于2 0g,则根据附录B查出重量校正系数C。试样中西加毒素的毒力按式(1)计算:X=MUCf(1)式中:X 试样中西加毒素
10、的毒力,单位为鼠单位毎五十克(MU/5 0g);MU 0.5m L小鼠腹腔注射液中所含的西加毒素的鼠单位数,单位为鼠单位毎五十克(MU/5 0g);C 小鼠体重校正系数;f 试样提取液的稀释倍数。1MU的定义为使体重为2 0.0g的无特定病原体级(S P F)昆明系雄性小鼠4 0 0m i n死亡的毒力,相当于9.1 0n g西加毒素。6.2 结果判断若实验组所有小鼠死亡时间大于4 0 0m i n,则该报告样品中西加毒素毒力小于0.9 8MU/5 0g。若实验组中位数死亡时间5 0m i n 4 0 0m i n,则按式(1)计算,并报告样品中西加毒素毒力为:MU/5 0g。若实验组中位数死
11、亡时间小于5 0m i n,则应对试样取液进行稀释,再选取3只小鼠进行实验,直到得到中位数死亡时间为5 0m i n 4 0 0m i n为止,根据式(1)计算,并报告样品中西加毒素毒力为:MU/5 0g。G B5 0 0 9.2 7 42 0 1 64 7 其他方法的检出限为0.9 8MU/5 0g。第二法 液相色谱-串联质谱法8 原理试样中的西加毒素经甲醇提取,C1 8固相萃取柱净化,液相色谱-串联质谱仪测定,外标法定量。9 试剂和材料除非另有说明,所用试剂均为分析纯,水为G B/T6 6 8 2规定的一级水。9.1 试剂9.1.1 甲醇(CH4O):色谱纯。9.1.2 甲酸(C2H4O2
12、):色谱纯。9.1.3 乙酸铵(C3H8C O2N):色谱纯。9.2 试剂配制9.2.1 乙酸铵溶液(1 0mm o l/L):准确称取0.0 7 7g乙酸铵于烧杯中,用适量水溶解,转移至1 0 0m L容量瓶中,用水定容至刻度,混匀。9.2.2 甲醇-乙酸铵溶液(1 0mm o l/L)(9 5+5):准确量取5m L乙酸铵溶液(1 0mm o l/L),转移至1 0 0m L容量瓶中,用甲醇容至刻度,混匀。9.2.3 甲醇溶液(5 0%):将甲醇和水等体积混合。9.3 标准品西加毒素标准品(P-C T X-1,C6 0H8 8O1 9)、(P-C T X-2,C6 0H8 8O1 8)、(
13、P-C T X-3,C6 0H8 8O1 8):纯度9 0%。9.4 标准溶液配制9.4.1 标准储备液(1m g/L):分别准确称取各适量(精确至0.1m g)的西加毒素(P-C T X-1,P-C T X-2,P-C T X-3)标准品,分别用甲醇配制成浓度为1m g/L标准储备液,于-1 8避光可保存6个月。9.4.2 混合标准中间液(0.0 1m g/L):分别吸取适量西加毒素(P-C T X-1、P-C T X-2、P-C T X-3)标准储备液(1m g/L),用甲醇稀释成西加毒素(P-C T X-1、P-C T X-2、P-C T X-3)浓度均为0.0 1m g/L的混合标准工
14、作液,于-1 8避光可保存3个月。9.4.3 基质匹配的标准系列工作液:吸取适量的混合标准中间溶液(0.0 1m g/L),用空白溶液配制成浓度为0g/L、0.1g/L、0.2 5g/L、0.5g/L、1.0g/L、1 0.0g/L的基质匹配的标准系列工作液。现用现配。9.5 材料9.5.1 C1 8固相萃取柱:2 0 0m g/3m L。使用前依次用6m L甲醇和6m L水活化,保持柱体湿润。9.5.2 微孔滤膜:0.2 2m,有机相型。G B5 0 0 9.2 7 42 0 1 65 1 0 仪器和设备1 0.1 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源(E S I)。1 0.2 分析天平:
15、感量0.1m g和0.0 1g。1 0.3 氮气浓缩仪。1 0.4 冻干机。1 0.5 粉碎机。1 0.6 离心机:转速50 0 0r/m i n。1 0.7 均质器:34 0 0r/m i n 2 40 0 0r/m i n。1 0.8 涡旋振荡器。1 0.9 超声波发生器。1 1 分析步骤1 1.1 试样制备水产品取其可食部分,切成小块,制成肉糜。于-1 8储存。1 1.2 试样提取称取5g(精确至0.0 1g)试样,经冻干后充分碾碎置于5 0m L具塞离心管中,加入1 0m L甲醇和5m L正己烷,以50 0 0r/m i n均质提取1m i n,涡旋混匀后超声提取1 5m i n,于5
16、0 0 0r/m i n离心3m i n,弃去上层正己烷相,将甲醇转移至试管中。残渣再用1 0m L甲醇重复提取一次,合并提取液,于4 5 以氮气浓缩至约5m L,加5m L水,混匀后待净化。1 1.3 试样净化将上述待净化液转入活化过的C1 8固相萃取柱中,以约1m L/m i n的流速使净化液全部通过,用6m L甲醇溶液(5 0%)淋洗并抽干。用4m L甲醇洗脱,收集全部流出液于2 0m L离心管中,于4 0以氮气浓缩至干。残渣用甲醇-乙酸铵溶液(1 0mm o l/L)定容至1m L,旋涡混合后过微孔滤膜,供液相色谱-串联质谱测定。1 1.4 仪器参考条件1 1.4.1 液相色谱参考条件a)色谱柱:C1 8柱,柱长5 0mm,内径2.1mm,粒径2.5m,或同等性能的色谱柱;b)柱温:3 0;c)进样量:2 0L;d)流动相、流速及梯度洗脱条件参见表1。表1 流动相梯度洗脱程序时间m i n流速m L/m i n含0.1%甲酸的乙酸铵溶液(1 0mm o l/L)%甲醇-含0.1%甲酸的1 0mm o l/L乙酸铵溶液(1 0mm o l/L)(9 5+5)00.2 55 05