1、G B/l 门 7 8 1 2-1 9 9 9前言 饲料中维生素E的测定目 前尚无国际标准，本标准是参照瑞士罗氏药品化学有限公司维生素研究部发表的 饲料中维生素、类胡萝 卜 现代分析方法 中“用高效液相色谱法测定配合饲料、预混合饲料 和浓缩维生素中的d l-a 一 生育酚”而制定的。在技术内容上参照该法，在编写格式上依据G B/T 1.1-1 9 9 3 标准化工作导则 第1 单元:标准的起草与表述规则 第1 部分:标准编写的基本规定 和G B/T 1.4-1 9 8 8 标准化工作导则 化学分析方法标准编写规定。为了使饲料中维生素E测定方法科学、准确、经济、实用，适合于我国不同实验室大量饲料
2、样品的测定，在参照国外分析方法的基础上增加了反相色谱测定条件。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出并归口。本标准由国家饲料质量监督检验中心(北京)负责起草。本标准主要起草人:陈必芳、赵小阳、李俊玲。中华人民共 和 国国家标准饲料中维生素E的测定 高效液相色谱法G B/t 1 7 8 1 2 1 9 9 9De t e r mi n a t i o n o f v i t a mi n E i n f e e d sH i g h-p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y1 范围本标准规定了饲料中维生素E的测定一 一 高效
3、液相色谱法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、复合预混料、维生素预混料中维生素E的测定。检测范围为每千克样品中含维生素E的量在1.I I U(d l-a 一 生育酚1 m g)以上2 弓!用标准 厂 列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文本标准出版时 所示版本均为 有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。G B/T 6 6 8 2-1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法3 方法原理 用碱溶液皂化试验样品，去除脂肪，使试样中天然生育酚释放出来并水解，添加的生育酚乙酸Li b 为游离的生育酚。乙醚提取未皂化的物质，蒸发乙醚，用正己 烷溶
4、解残渣。提取物注入高效液相色iA柱.用紫外检测器在2 8 0 n m处测定，外标法计算维生素E(d l-a 一 生育酚)含量4 试剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合G B/T 6 6 8 2中用水规定4.1 无水乙醚:无过氧化物。4.1.1 过氧化物检查方法:用5 m L乙醚加1 m L 1 0 0 o 碘化钾溶液，振摇 1 m i n，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色，或加0.5 0 0 淀粉指示液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。4.1.2 去除过氧化物的方法:乙醚用 5%硫代硫酸钠溶液振摇，静置，分取乙醚层，再用蒸馏水振摇，洗涤两次
5、，重 蒸，弃去首尾5%部分，收集馏出的乙醚，再检查过氧化物，应符合规定。4.2 乙醇4.3 正1 1,烷:重蒸馏(或光谱纯)。4.4 1,-I-二 氧六环。4.5 甲醇:优级纯。4.6 2,6 一 二叔丁基对甲酚(B H T)4.7 无水硫酸钠4.8 氢氧化 钾溶液:5 0 0 g/I。国家质量技术监督局1 9 9 9 一 0 8 一 1 0 批准2 0 0 0 一 0 2-0 1 实施G B/r 1 7 8 1 2-1 9 9 94 1 9 抗坏血酸乙醉溶液5 川L;取。.5 g 抗坏血酸结晶纯品溶解于4 m l温热的蒸馏水中 用乙醇稀释至1 0 0 n il，临用前配制4.1 0 维生*E
6、(d l-a生,y 酚)标准溶液4.1 0.1 d l-a 一 生育酚标准贮备液:准确称取d l-a 一 生育酚纯品油剂C U S P)1 0 0.0 m g 于1 0 0 m l棕色容敏瓶中，用正己 烷溶解并稀释至刻度，混匀，4 C 保存，该贮备 液浓度每毫升含 维生素E l.0 m g4.1 0.2 d l-,一 生育酚标准L 作液 准确吸取d l-a 一 生育酚贮备液(4.1 0.1)用正己 烷(4.3)按 1;2。比例稀释。若用反相色谱测定，将 1.0 0 n i l,d l-a生育酚标准贮备液代八 1 0 ml棕色小容址瓶中.用氮气吹干.用甲醇(4.5)稀释至刻度、混匀 再按比例稀释
7、。配制上 作液浓度为每皂升含维生素E 5 0 p g4.1 1 酚酞指示剂乙醇济液:1 0 g/l。4 _ 1 2 氮气(纯度9 9.9 i;,)。仪器、设备实验室常用设备。圆底烧瓶，带回流冷凝器。J巨温水浴或电热套旋转蒸发器超纯水器(或全磨!玻璃蒸馏器)。高效液相色谱仪，带紫外检测器。，.9、55乐5545.5566 试样的制备 选取有代表性的 饲料样品至少5 0 0 g，四 分法缩减至1 0 0 g,磨碎，全部通过。.2 8 m m孔筛、混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。了 分析步骤了 门试验溶液的制备7.1 门皂化 称取试样配合饲料或浓缩饲料1 0 g，精确至。.0 0 1 g，维
8、生素预混料或复合预混料1-5 g 精确至0.0 0 0 1 g锻入2 5 0 m L圆 底烧瓶中，加5 0 m L 抗坏血酸乙 醇溶液(4-9)，使试样完 全分 散、浸 湿、置于水浴上加热，混合直到沸点，用氮气吹洗稍冷却，加1 0 m l氢氧化钾溶液(4.8),混合均匀.在氮气流I 沸腾皂化回流3 0 m i n不时振荡防止试样粘附在瓶壁上，皂化结束，分别用5 m L乙醇,5 m l水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至约4 0 C,7.1.2 提取 定垦的转移全部皂化液于盛有1 0 0 m L乙醚(4-1)的5 0 0 m l分液漏斗中，用3 0 5 0 m l蒸馏水分2-3 次冲洗圆底烧
9、瓶并入分液漏斗，加盖、放气，随后混合，激烈振荡2 m i n,静置、分层。转移水相于第二个分液漏斗中 分次用1 0 0,6 0 m L乙醚重复提取两次，弃去水相，合并三次乙醚相。用蒸馏水每次1 0 0 m l,洗涤乙醚提取液至中性，初次水洗时轻轻旋摇，防止乳化。乙醚提取液通过无水硫酸钠(4.7)脱水，转移到2 5 0 m l 棕色容量瓶中，加1 0 0 m g B H T(4.6)使之溶解.用乙醚定容至刻度(V)。以上操作均在避光通风柜内进行7 门.3 浓缩 从乙醚提取液(v)巾分取一定体积(V IJ 依据样品标示量、称样量和提取液量确定分取量)置于旋转蒸发器烧瓶中.在部分真空，水浴温度约5
10、0 的条件下蒸发至干或用氮气吹干。残渣用正己烷溶解(反相色谱用甲 醇溶解)，并稀释至 1 0 m L(V-)使其获得的溶液中每毫升含维生素E(d l-a 一 生育酚)5 0-1 0 0 u R 离心或通过。.4 5!+。过滤膜过滤，收集清液移入2 m L小试管中 用于高效液相色谱仪分析G B/T 1 7 8 1 2-1 9 9 97.2 测定了.2 门高效液相色谱条件7.2.1.1 正相色谱 柱长:1 2.5 c m，内径4 m m，不锈钢柱。固定相:硅胶L i c h r o s o r b s i 6 0,粒度5 p m,移动相:正己烷+1,4 一 二氧六环(9 7+3)，恒量流动。流速:
11、1 m L/m i n,温度:室温。进样体积:2 0 p L,检测器:紫外检测器，使用波长2 8 0 n m,保留 时间:4.3 m i n7.2.1.2 反相色谱 柱长:1 2.5 c m，内径4 m m，不锈钢柱。固定相:O D S(或C 1 8)，粒度5 p m,移动相:甲 醉十水(9 5+5),流速:1 m L/m i n,温度:室温。进样体积:2 0 可。检测器:紫外检测器，使用波长2 8 0 n m,保留时间:1 1.1 7 m i n,7.2.2 定量测定 按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度(A U F S)，色谱峰分离度符合要求(R-1.5)(中国 药典1 9 9
12、5 版附 录)。向 色谱柱注入相应的维生素E(d l-a 一 生育酚)标准工作液(4.1 0.2.V)和试验溶液(7-1.3.V i)得到色谱峰面积的响应值(P-P J，用外标法定量测定。8 结果的计算与表述8.1 计算公式结果按式(1)计算:之 日 1=P;XV。二 XV,XP 只 M X V,;X.(1)认-大八-琶式中:听 每千克样品中含维生素E的量，I U(或m g);m 样品质量+g;V 提取液的总体积,m L;V 从提取液(V,二)中分取的溶液体积，m L;V-试验溶液最终体积,m L;A 标准溶液浓度，l g/m L;V,维生素E标准溶液进样体积,k L;V;从试验溶液中分取的进样体积,p L;P与标准溶液进样体积(V,)相应的峰面积响应值;尸.与从试验溶液中分取的进样体积(V)相应的峰面积响应值;f 一一转换系数.1 国际单位(I U)维生素E相当于。.9 0 9 m g d l-a 一 生育酚，或1.0 m g d l-.一 生育 酚乙酸酷。8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数 3 位c s/T 1 7 8 1 2-1 9 9 99 允许差同一 分析者对同一试样同时两次测定(或重复测定)所得结果相对偏差。每千 克试样中d l-a 一 生育酚含量,m g相对偏差，%1 1 0士2 0 1 0士1 0