1、中华 人 民共 和 国 国家 标 准饲 料 中 维 生 素 B:测 定 方 法Me t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f V i t a mi n B 2 i n f e e d sG B/T 1 4 7 0 1 一9 31 主题内容与适用范围 本标准规定了 饲料中维生素B z 测定方法。本标准适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、维生素预混料中维生素B:的测定。待测液中维生素B，检测 浓度为。0 5 0.2 p g/m L.2 引用标准G B 6 6 8 2 实验室用水规格3 方法原理 维生素B 2(即核黄素C u H z o N,0
2、 6)在4 4 0 n m紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比 值 计算祥品核黄素的含最。4 试剂和溶液 除特 殊规定外，本标准所 用试剂 均为 分析纯，水为 蒸馏水或相 应纯度的 水。4.1 盐酸溶液，0.1 m o l/L:将8.5 m L 盐酸(G B 6 2 2)用 水稀 释至1 0 0 0 m L4.2 盐酸溶液，1 m o l/L o4.3 氢氧化钠(G B 6 2 9)溶液，1 m o l/L,4.4 冰乙酸(GB 6 7 6)4.5 冰乙 酸溶液，0.0 2 m o
3、 l/L:将1.8 m L 冰乙 酸用水稀释至1 0 0 0 m 1。4.6 高锰酸钾(G B 6 4 3)溶液，4 0 g/L,4.7 过氧化氢(H G 3-1 0 8 2)溶液,1 0 0 m L/L。现用现配。4.8 核酸素标准溶液4.8.1 核 黄素 贮备 液工核 黄素(中 国 药 典 参照 标 准)，于 五 氧 化 二 磷千 燥器中 干 燥2 4 h，称 取0.0 5 0 0 g，溶解于。0 2 m o l/1 乙酸 溶 液(4.5)中，在蒸汽 浴上恒速搅动直至 溶解，冷却后稀 释至5 0 0 m L e盛入棕色瓶滴加甲 苯覆盖，低温(4 0C)保存。该溶液每毫升含。.1 m g 核
4、黄素。4.8.2核 黄 素 贮 备 液II:取 核 黄 素 贮 备 液1(4.8.1)1 0 m L 用。.0 2 m o l/L 乙 酸 溶 液 稀 释 至1 0 0 m L，盛于棕色瓶中滴加甲苯覆盖，低温(4 C)保存 该溶液每毫升中含1 0 I g 核黄素。4.8.3核黄素 标准工作液:取核黄素 贮备液1(4.8.2)1 0 m L，用水稀释至1 0 0 m L。现用 现配 该溶液每毫升中含1 F i g 核黄素。一.一 一一 一一-户一，一一，.一-州 一种 一一.一一月 一一 一-国家技术 监督局1 9 9 3 一 1 1 一 0 6 批准1 9 9 4 一 0 6 一 0 1 实
5、施G B/T 1 4 7 0 1 一 9 34.9 荧光素标准溶液4.9.1 荧光素贮备液:称取荧光素(Q/H G 2 2-7 8 6)0.0 5 0 0 g，用水稀释至1 0 0 0 m L,盛于棕色瓶中，低温(4 C)保存 该溶液每毫升中含5 0 p g 荧光素。4.9.2荧 光 素 标 准 工 作 液:取 荧 光 素 贮 备 液(4.9.1)1 m L，用 水 定 容 至1 0 0 0 m L,盛 入 棕 色 瓶中，低 温保存。该溶液 每毫升中 含。.0 5 p g 荧 讹素。4.1 0 澳钾酚绿p H指示剂:取澳钾酚绿(H G B 3 3 8 6)0.1 g，加氢氧化钠溶液(0.0 5
6、 m o t/L)2.8 m L使之溶解，再加水稀释至2 0 0 m L。变色范围p H 3.6 5.2,4.1 1 连二亚硫酸钠(N a,S,O,)(Q/H G 2-0 0 1)，防止吸潮。仪器、设备荧光分光光度计。分析 天平:感量0.0 0 0 1 g o电热恒温水浴。具塞玻璃刻度试管，1 5 m L e51525354试样的制备 采集具有代表性的样品至少5 0 0 g，四分法缩减至1 0 0 g，磨碎，通过。.2 8 m m孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。分析步驻7.1 称样:单 一 饲料、配合饲料、浓缩饲料称取1-2 g,精确至。.0 0 1 g。维生素预混料称取。.2
7、5-0.5 0 g，精确至。.0 0 0 1 g，将试样置于1 0 0 m L容量瓶中。7.2 样液的制备:向盛样品的容量瓶中加6 5 m L盐酸溶液(4.1)，于沸水浴中加热 3 0 m i n,开始加热5-1 0 m i n 时常摇动容量瓶，以防样品结块。或于1 2 1-1 2 3 C 1 5 磅高压釜中加热3 0 m i n。冷却至室温后，用氢氧化钠溶液(4.3)凋节p H至6.0-6.5，然后立即加稀盐酸溶液(4.2)使p H值约为4.5(澳甲酚绿指示剂变为草绿色)。用水稀释至刻度。通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初5 -1 0 m L溶液，收集滤液于1 0 0 m L锥形瓶中。取整份清液
8、，滴加稀盐酸检查蛋白质如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，剧烈振摇，使之沉淀完全稀释到测量体积。对高含量样品，取整分的澄清液，用水稀释至一定体积使含核黄素约为。.1 p g/m L(以下操作避免紫外光照射)。7.3 杂质氧化:于a,b,c 三支1 5 m L刻度试管(5.4)中各吸入样液(7.2)1 0 m L，同时做平行，向试管a,c 中各加入1 m L蒸馏水，向试管b 中加入1 m L核黄素工作液(4.8.3)。然后各加人冰乙酸(4.4)1 m 1，旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液(4.6)0.5 m L,旋摇混匀，静置2 m i n，再逐个加入过氧化氢溶液(4.7)0.5 m L旋摇，使高锰酸
9、钾颜色在1 0 s 内消退。加盖摇动，使试管中的气体逸尽。7.4 测定:用荧光素溶液(4.9.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调整激发波长4 4 0 n m，发射波长5 2 5 n m，测定试管a,b 的荧光强度，样液在仪器中受激发光照射不超过 1 0 s o在试管c 中加入2 0 m g 连二亚硫酸钠，摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定其荧光强度作为空白。若溶液出现浑浊，不能读数。分析结果的计算和表述8 门计算方法和公式G B/T 1 4 7 0 1 一 9 3 核黄素(维生素B,)含量以m g/k g(或g/k g)表示，按下式计算:一、*、_，、A一CM
10、 V 核黄素(V B z m 只/k 又)=书 于 X上X弃 XR 、.、一 一 创 沛 B 一A、m V,、式中:A 试管a(样液加水)的荧光强度;B一一 试管b(样液加标样)的荧光强度;c 试管c(样液加连二亚硫酸钠)的荧光强度;M一一 加入核黄素标样的量,Kg;V-一一 样液的初始体积，m L;V 一一测定时分取样液的体积，m L;m 试样质量，9。R一一 稀释倍数。A-c二、_，_ _、_ _ B-A 值 应 在。6 6-1.5 否 则 需 调 整 样 液 的 浓 度。8.2 平行测定结果用算术平均值表示，保留有效数3 位。9 重复性同一分析者对同一试样同时或快速连续进行两次测定，所得结果之间的差值:在核黄素含量小于或等于5.0 m g/k g 时，不得超过平均值的1 5 0 o.在核黄素含量大于5.0 m g/k g 时，不得超过平均值的l o yo e在核黄素含量大于 5 0 m g/k g 时不得超过平均值的5%.附加说明:本标准由全国饲料工业标准化技术委员会提出。本标准由国家词料质检中心(北京)负责起草。本标准主要起草人陈必芳、李兰、俞巧玲、曹建民。本标准参照采用A O A O 1 9 9。年版(9 7 0.6 5)测定方法。