1、G B/T 5 4 1 3.2 5-1 9 9 7前言 本标准等同采用美国公职分析化学师协会(A O A C)方法，测定的是具有生物效价的肌醉含量。本系列标准从实施之日 起，代替G B 5 4 1 3-8 5,本标准由中国轻工总会提出。本标准由 全国乳品标准化中心归口。本标准负贵起草单位:国家乳制品质量监份检验中心。本标准参加起草单位:卫生部食品卫生监份检验所、浙江省轻工业研究所、哈尔滨森永乳品有限公司、雀集(中国)投资服务有限公司.本标准主要起草人:张玉杰、王芸、房玉国、王克新。中华 人民 共 和 国 国 家 标 准婴 幼 儿 配 方 食 品 和 乳 粉G s/T 5 4 1 3.2 5-1
2、 9 9 7肌 醇 的 测 定代替G B 5 4 1 3-8 5Mi l k p o w d e r a n d f o r m u l a f o o d s f o r i n f a n t a n d y o u n g c b i l d r e n-De t e r mi n a t i o n o f i n o s i t o l，范围 本标准规定了肌醇的测定方法。本标准方法一适用于婆幼儿配方食品和乳粉中肌醇的测定，方法二适于乳粉中肌薛的测定.方法一徽生物法2 方法原理通过S a c c h a r o m y c e s u v a r u 二的生长情况来评价肌醉的含量。3
3、试荆、菌种和培养荃 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。3.1 盐酸:体积比为1，1 将体积分数为3 7%的浓盐酸S O m L 用水稀释至l O O m L,3.2 氢氧化钠:c(N a O H)为l m o l/L 将4 鲍氢氧化钠溶解于水中，稀释至l 0 0 0 m L,3.3 肌醉标样:无水晶体。3.4 菌种 S a c c h a r o m y c e s u v a r u m,3.5 培养基3.5.1 链泡排菌琼脂培养基:3 号蛋白 陈5 g,酵母浸膏5 g,麦芽糖4 0 g,琼脂1 5 g,3.5.2 肌醉测定用培养基:葡萄糖1 o
4、 o g,柠檬酸钾l o g，柠檬酸2 g,磷酸二氢钾1.1 g,撅化钾0.8 5 g，硫酸镁。.2 5 g,抓化钙。.2 5 g,硫酸锰5 0 m g,盆化亚铁5 0 m g,D L 一 色氨酸8 0 m g,L-$t 氨酸。.1 g,L 一 异亮氨酸0.5 g,L-赖氮酸0.5 g,L 一 蛋氮酸0.2 g,D L 一 苯基丙氨酸0.2 g,L-酪氨酸0.2 g,L 一 天门冬酞胺0.8 g,D L 一 天门冬氮酸0.2 g,D L 一 丝氮酸0.l g，甘氨酸。.2 g,D L 一 苏氨酸0.4 g,L-绷氨酸0.5 g,L 一 组氨酸。.1 2 4 g,L-脯氮酸0.2 g,D L 一
5、 丙氨酸。.4 g,L 一 谷氨酸。.6 g,L-精氨酸0.4 8 g,盐酸硫胺素5 0 0 p g，生物素1 6 p g,泛酸钙5 m g,盐酸毗哆醉l m g，加蒸馏水至1 0 0 0 m L,p H 5.2 士0.2(2 5 0C),4 仪器 常用实验室仪器及:4.1 p H计。国家技术监，局1 9 9 7 一 0 5 一 2 8 批准1 9 9 8 一 0 9-0 1 实施G B/T 5 4 1 3.2 5-1 9 9 7:.;2 5 0 mL比色仪圆底烧瓶，与冷凝器连接的锥形玻璃接头。5 样品制备5.1 贮备菌种的制备5.1.1 从纯菌种S u v a、二中转接2 个以上已制备好的麦
6、芽浸出汁琼脂斜面。3 0 培养1 6-2 4 h,贮于冰 箱中，保 存期不 要超过2 周，然后 再转挤到新的 琼脂斜面 上。5.1.2 接种的准备 最好在使用的当天从贮备菌种中 转接到新配制的麦芽浸出汁琼脂斜面上，3 0 培养1 6 -2 4 h。用接种环无菌地转接该菌种到一个灭菌生理盐水中，直到得到一定浓度菌体细胞的悬浮液。为了测定，制备一个醉母菌悬浮水溶液，这个悬浮液中酵母菌的浓度在。.l m g/m L。分光光度计事先用水调到1 0 0 0 0 透光率，然后测定这个“标准”醉母菌的透光率。将新接种斜面中的菌体细胞移人到无菌生理盐水中，其浓度直到达到与上述标准溶液具有相同的透光率为止。5.
7、2 标准溶液5.2.1 标准贮备液，肌醇的浓度为。.2 m g/m L,称取1 0 0 m g 肌醉(该肌醉标样已 放在干燥器中 干燥2 4 h)，于容量瓶中 用水稀释至5 0 0 m L,贮于冰箱。5.2.2 标准工作液，肌醉的浓度为2)a g/m L,吸取5 m L(5.2.1)溶液，用水稀至S O O m L，定容。当天制备。6 如作步蕊6，样品的处理6，.1 干粉样品 精确称取一定量样品，这些样品中约含肌醇0.5 m g，移入2 5 0 m L因 底烧瓶中，加1 0 0 M L盐酸(1:1)(3.1),继续6.1.3 步骤。6.1.2 液体样品。吸一定量样品，这些样品中 约含肌醇0.5
8、 m g，加1 0 0 m L 盐酸(3.1)，继续6.1.3 步骤。6.1.3 将装样品的圆底烧杯与冷凝器联结，经过6 h，通过蒸馏将盐酸除去。将剩余物用燕馏水冲到烧杯中，用 l m o l/L氢氧化钠将溶液的p H值调至5.1 士。.1,稀释至2 5 0 m L，过滤，弃去前部几毫升。这个溶液肌醇的浓度均为2 k g/m L,6.2 标准曲线 按表1 顺序加入燕馏水、标准溶液于培养管中，一式三份.表 1试管号N o.12345、67燕馏水，M L5543210标准溶液,m L0012345按表2 顺序加入蒸馏水、样品溶液于培养管中，一式三份。表 2试管号N o.1234燕馏水，.L4321
9、样品溶液,m L123 4c B/T 5 4 1 3.2 5-1 9 9 76.4 热处理 用棉塞或不锈钢帽盖住所有试管，1 0 0,C 蒸汽蒸1 0 m i n,6.5 接种 冷却试管至3 0 以下。无菌添加接种物于基础贮备培养基中，以每 1 0 0 m L添加2 m L的比例添加，充分混合，将上述已 接种的培养基无菌加入到6.2 和6.3 的每个测定管中，每管加5 m L(其中标准曲线中N o.1 号试管只加5 m L未接种的培养基)。6.6 培养 将试管固 定在机械振荡器上，以每分钟振荡1 0 0-V 2 0 0 次的往复运动中，2 8-3 0 之间选择一个恒定温度(士0.5 C)培养2
10、 2-2 4 h,6.了 测定 从振荡器上取下试管，于 1 0 0 1C 蒸5 m i n 或每管加1 滴杀菌剂(T h o r a l)，以使其停止生长。试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是清的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。充分混合每一个试管(也可以加一滴消泡剂)，将反应液加到比色皿内，搅拌内容物，将比色皿放入到分光光度计的比色池内，波长为5 4 0-6 6 0 n m，读出透光率或吸光度，稳定3 0 s，每个试管稳定时间要相同。对于未接种管，将其透光率调到1 0 0%(或吸光度为0)，读出其他接种空白管的读数。将接种空白 管的透光率
11、调到1 0 0 0 a(或吸光度为0)，依次读出其他每个管。对每个水平的测试溶液，计算每毫升中维生素的含量，计算所得值的平均数，每个管测得值不得超过该平均值的士1 5%。如果所得到的管数，少于所测定的四种水平的稀释液的管数的2/3，用于计算样品浓度的数据是不充分的。如果剩余管数是原来管数的2/3 或更多，则可根据平均值计算其样品的含量 注:不可使用金属帽(除了不锈钢盖)，这是由于试管在培养振荡过程中有金属污染的可能性.了 分析结果的衰述 样品中肌醇的含量(m g/l 0 0 g 或m g/1 0 0 m L)二式中:X-测定管中每毫升测试溶液中肌醇含量的平均值，K g 。样品的质量或体积，g
12、或m l。8 允许理 同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的1 0%.方法二 气相色谱法9 方法提要 样品中的肌醇与衍生剂反应后，经气相色谱时行分离定量。1 0 试剂1 0.1 N 一 三甲基硅基咪哇。1 0.2 三甲基抓硅烷。1 1 仪器们.，气相色谱仪:F I D检测器。义 1 0 0“。(1)沐X-叨G s/T 5 4 1 3.2 5-1 9 9 71 1.2 色谱柱:5 0%P h e n y l m e t h y l c l o x a n e,D b-1 7(J&w).0.3 2 m m i d X 3 0 m 0.2 5 p m.1 2 操作步骇1 2.1准 确称取l
13、g 样品 于烧杯中，用温 水溶解，转至1 0 0 m L 容量瓶中，定容。取5.O m L 该溶液放入小试管中作为测定液。1 2.2 准确称取5 0 m g 肌醉标样于小烧杯中，用水溶解，转至1 0 0 m L 容量瓶中，定容。用吸量管取该溶液5 m L于一1 0 0 m L容量瓶中，用水定容。取此溶液2 m L于小试管中。1 2.3 将上述分别含有样品和标准溶液的试管冷冻干燥。于每个试管中加1 m L内 标溶液(每毫升毗吮中 含0.0 5 m g 的蕙)，盖紧塞子，放置1 5 m i n.于每个试管中加。.5 m L的N 一 三甲 基硅基咪哇和。.2 m o l/L的，混合，静置 1 5 m
14、 i n 后进样。1 2.4 气相色谱条件:a)柱温:1 4 0 -2 6 0 C WC/mi n);b)检测器:F I D;的 检测器温度s 2 8 0 0C;d)进样器:s p l i t(1:4 0);。)进样器温度:2 8 0 1C;f)进样体积s I p L;g)流速:1.4 m L/m i n.1 3 分析结果的衰迷 样品中 肌醉含量(m g/l o n g)式中:标准工作液浓度,a s/m L;A./A.片1-气-了 X n./n s 2 0 0 X cX 2 0 0 ，滩(6)A.样品峰面积;A.-标样峰面积，A.样品内标峰面积，A.-标样内标峰面积;，样品的质量，9。允许差同一样品两次测定值之差不得超过两次测定平均值的5%.