1、G B/T 5 4 1 3.1 6-1 9 9 7前言 本标准等效采用美国 公职分析化学师协会(A O A C)方法。本系列标准从实施之日 起，代替G B 5 4 1 3-8 5,本标准由中国轻工总会提出。本标准由 全国 乳品标准化中心归口。本标准负责起草单位:国家乳制品质量监督检验中心。本标 准参加 起草 单位:卫生部食品 卫生 监督检验所、浙江省 轻工业研究所、哈尔滨 森永乳品 有限 公司、雀巢(中国)投资服务有限公司。本标准主要起草人:殷晓红、王芸、杨金宝、张玉杰。中华 人 民共 和 国 国 家标 准婴 幼 儿 配 方 食 品 和 乳 粉G B/T 5 4 1 3.1 6-1 9 9 7
2、叶 酸(叶 酸 盐 活 性)的 测 定代替G B 5 4 1 3-8 5Mi l k p o w d e r a n d f o r m u l a f o o d s f o r i n f a n t a n d y o u n g c h i l d r e n -D e t e r mi n a t i o n o f f o l i c a c i d(f o i a t e a c t i v i t y)1 范围 本标准规定了用微生物法测定叶酸(叶酸盐活性)的方法。本标准适用于婴幼儿配方食品和乳粉中叶酸(叶酸盐活性)的测定。2 方法原理 叶酸盐的活性通过干酪乳杆菌(L a c t
3、 o b a c i l l u s c a s e i)的生长情况来评价。3 试荆、菌种和培并基 所有试剂，如未注明 规格，均指分析纯;所有实验用水，如未注明 其他要求，均指三级水。3.1 鸡胰腺:称取1 0 0 m g 干燥的鸡腆腺，加 2 0 m L蒸馏水，搅拌1 5 m i n,离心 l O m i n(3 0 0 0 r/m i n)，取上清液用。现用现配。3.2 生理盐水:称。.9 g 抓化钠(分析纯)于1 0 0 m L容量瓶中，稀释至刻度，振荡溶解。分装l O m L到每个培养管中，盖上盖,1 2 1 灭菌2 0 m i n，每周准备一次。3.3 磷酸缓冲液:c(H,P O,)
4、为。.0 5 m o l/L，含有抗坏血酸。溶解5 0 m g 抗坏血酸于l o o m L O.0 5 m o 1/L 磷酸缓冲液中，现用现配。3.4 叶酸，标准品。3.5 浓氨水。6 甲苯。7 菌种:干酪乳杆菌(L a c t o b a c i l l u s c a s e i).8 培养基。33.3.8.1 乳酸杆菌琼脂培养基:陈化乳1 5 g,醉母浸膏5 g,葡萄糖l o g，番茄汁 1 0 0 m L,磷酸二氢钾2 g,聚L l1 梨 糖单油酸醋1 g,琼脂l o g，加燕 馏水至1 0 0 0 m L,p H 6.8 士 0.2(2 5 0C),3.8.2 乳酸杆菌肉 汤培养基
5、:陈化乳1 5 g,酵母浸膏5 g,葡萄搪l o g，番茄汁l 0 0 m L,磷酸二氢钾2 g,聚山 梨搪单油酸醋l g，加燕馏水至l O O m L,p H 6.8 士0.2(2 5-C),3.8.3叶 酸 测 定 用 培 养 基:酪 蛋 白 陈l o g,葡 萄 糖4 0 g，乙 酸 钠4 0 g,磷 酸 氢 二 钾1 g,磷 酸 二 氢 御1 g,D L-色氨酸0.2 g,L 一 天门冬氨酸0.6 g,L 一 半肤氨酸盐酸盐。.5 g,硫酸腺嗦吟1 0 m g,盐酸鸟嗦吟1 0 m g，尿啼吮1 0 m g.黄嗦吟2 0 m g,聚山梨搪0.1 g，谷光甘肤5 m g,硫酸镁0.4 g
6、,氯化钠2 0 m g,硫酸亚铁2 0 m g,硫酸锰 1 5 m g，核黄素 l m g,p-氨基苯甲酸2 m g，维生素B 6 4 m g,盐酸硫胺素4 0 0 p g,泛酸钙8 0 0 p g，烟酸8 0 0 f a g，生物素2 0 p g，加燕馏水至1 0 0 0 m L,p H 6.7 士0.1(2 5 0C),3.9 氢氧化钠溶液:c(N a O H)为0.l m o l/L,国家技术监，局1 9 9 7 一 0 5 一 2 8 批准1 9 9 8 一 0 9 一 0 1 实施c s/T 5 4 1 3.1 6-1 9 9 74 仪器 常用实验室仪器及4.1 培养箱。4.2 灭菌
7、釜。4.3 培养管和帽。4.4 试管振荡架。4.5 接种针和接种环。4.6 p H计。4.了 离心机。5.1制备 菌种的制备5.1.培养养基菌种植物乳杆菌(L a c t o b a c i l l u s2 4 h，每月接种一次，标好，贮于冰箱中。c a s e i)从菌种培养基上接种到三个转接培养墓试管中，3 7 0C再以每月接种的培养管(4.3)的一支中再接种 1 支转接培,3 7 培养2 4 h，每周做一次这样的转接，每周从接种管中 接种4 -5 支转接培养基接种管,3 7 培2 4 h，标好，作为每日 测定用。每月月初从月接种管中重新接种3 个转接管保存新菌种。5.1.2 从日 接种
8、管中 接种一管于菌种培养基中，3 7 培养2 4 h。在无菌条件下离心该培养液1 O m i n(2 0 0 0 r/m i n),倾去上清液，再用 l O m L生理盐水(3.2)将细菌细胞清洗，再离心 l O m i n(2 0 0 0 r/m i n去上清液，再用另外的1 0 m L生理盐水(3.2)清洗。如前面一样离心，弃去上清液，再加l O m L)，倾0.2)。吸1 m L该菌悬液于l O m L生理盐水(3.2)中，混合均匀。生理盐水:一:.，标准溶液的制备标准贮备液，叶酸的浓度5 0 0 y g/m L,精确称取5 5-5 6 m g 叶酸标准品(3.4)，用5 0 m L蒸馏
9、水定量地转人1 0 0 m L容量瓶中，加2 m L(3.5),溶掖制备后，计算溶液的 体积，要求贮备液中叶酸盐的浓度为5 0 0 p g/m L;氨水贮备液体积(m L)X 1 0 0 0 X1 0 0 X 5 0 0或简化为贮备液体积(m L)_m_ X5 0式中:，标样的质量,m g;c 标样的纯度，g/l 0 0 g,用燕馏水稀释溶液至刻度，用吸管加蒸馏水到所要求的计算得到的休积，色瓶子中，贮于冰箱。保存期为4 个月。5.2.2 标准中间液，叶 酸的浓度5 0 p g/m L,精确吸取l O m L标准贮备液(5.2.1)液于合，贮于冰箱中，保存期 1 个月。5.2.3 标准工作液，叶
10、酸的浓度。l n g/m L,充分混合，放入红色或棕1 0 0 m L棕色或红色容量瓶中，用蒸馏水稀至刻度，充分混 吸取1 mL标准中间液(5.2.2)于1 0 0 m L于1 0 0 m L 棕色容量瓶中，定容.混合。徐色容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混合。再吸该液1 m L再从上液中吸5 m L于2 5 0 m L棕色容量瓶中，用。0 5 m o 1/L磷酸级冲液定容到刻度，混合，即为标G B/T 5 4 1 3.1 6-1 9 9 7准工作液(0.0 0 0 1 p g/m L或0.l n g/m L)。每次测定前制备。6 操作步软6.1 测定溶液的制备6.1.1 粉状样品 精确称取一定
11、量的样品(样品中约含有5 p g 叶酸)于1 0 0 m L 烧杯中，用2 5-3 0 m L水复原样品，定量地转入1 0 0 m L容量瓶中，用燕馏水定容至刻度。接 6.1.3 步骤继续。6.1.2 液体样品 吸取定量的样品，大约含5 p g 的叶酸于1 0 0 m L容量瓶中，用水定容至刻度，接6.1.3,6.1.3 溶液中 叶 酸的质量浓度大约为0.0 5 p g(5 0 n g)/m L 吸1 m L稀释样品和 1 m L 鸡腆腺(3.1)于一个1 8 m m X 1 5 0 m m的带螺旋盖的培养试管中，充分混合。加1 8 m L 0.0 5 m o l/L含抗坏血酸的碑酸缓冲液(3
12、.3),再加1 m L甲 苯(3.5)。作一个空白 对照管，吸1 m L燕馏水和 1 m L鸡胰腺于空白管中，也加。.0 5 m o l/L缓冲液(3.3)1 8 m L及 1 m L甲苯(3.5),于3 7 C 培养样品管和空白 管 1 6 h，再于 1 2 1 灭菌 1 0 m i n，之后离心，用。.0 5 m o l/L磷酸缓冲液稀释，得到叶 酸盐的质量浓度约为0.l n g/m L的 溶液。6.2 标准曲线的制备 按表1 顺序加人燕馏水，标准溶液和叶酸测定用培养基于培养管中，一式三份。表 1试管号N o1234567891 0燕馏水，m L5543210210标准溶液1 ,m L00
13、12345345培养基,m L55555555551)试管N o.3 -7 中加低浓度标准溶液;N o.8 -1 0 中加高浓度标准溶液。按表2 顺序加燕馏水、样品溶液和叶 酸测定用培养基于培养管内，一式三份。表 2试管号N o.1234燕馏水，m L4321样品，mL1234培养荃,m L5555_直 接 灭 菌 所 有 的 试 管，制 冷 到 培 养 温 度 或 迅 速 放 入 循 环 水 浴 内，以 使 颜 色 形 成 最 洗保 证 加 热 和 制冷条件均匀(灭菌管数过多或距离太近，在灭菌锅中 都可产生不良 影响)。1 2 1 灭菌1 0 m i n.接种无菌的接种每个管，均加入一滴适当
14、的接种物。除标准管N o.7 以外。盖上盖，充分振荡混合所有培养在2 8 4 0 之间选择一个恒定温度(土。.5 0C)，培养6 0 -7 2 h,测定(酸度法)0U，16.管6.6.试管被任何外来微生物污染则测定无效清的，标准和样品中无其他菌生长。通过对每个试管的视觉检查进行反应的预测，未接种管是G s/T 5 4 1 3.1 6-1 9 9 76.7.1 滴定 用滇庸香草酚蓝作指示剂，用0.l m o l/L氢氧化钠0.9)滴定每个管中溶液，或以p H 6.8 作为电位滴定终点。如果接种空白 滴定反应等于或高于未接种空白水平的1.5 m L，则测定结果应忽略不计。通常标准溶液在5.O m
15、L的反应等于0.l m o l/L氢氧化钠 8 一 1 2 m L的滴定度。6.7.2 测p H值 在培养之后读出管内 容物的p H值，近似至。.O l p H值单位。6.8 计算 对于每个标准溶液作出一个浓度反应曲线(酸度，p H值，透射率或吸收值)，每个管中 分别含有相对应的参考标准含量。对每个水平的检验溶液进行维生素的定量测定，废弃任何低于 0.5 m L标准溶液的吸收值或高于4.5 m L标准溶液的吸收值。对每个水平的检验溶液，计算其每毫升中的维生素含量。计算所得值的平均数，得超过该平均值的士1 5%,如 果 所 得 到 的 管 数 少 于 所 测 定 的 四 种 水 平 的 稀 释每个管的测得值不液 的管救的2/3，用 于计算样品浓度的数据就是不充分的。如果剩余管数是原来管数的2/3 或更多，则可根据平均值计算其样品中的含量。了 分析结果的衰迷 样品中叶酸含量(m g 八o o g 或l 0 0 m L)=(X X D)一 B X式中:X不同水平检验溶液其每毫升中的叶酸含量值，n g;1 0 01 0 0 0 m”(2)D-1 m L样品在经过酶处理后的稀释度;E B-酶处理液空白 管中叶酸含量值，n g/m L;m 最初称(吸)取样品的质量,g(或m L),8 允许差同一样品的两次测定值之差不得超过两次测定平均值的1 0%0