1、GB/T 5009.251996 中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准 食品中杂色曲霉素的测定方法食品中杂色曲霉素的测定方法 Method for determination of sterigmatocystin in foods GB/T 5009.251996GB/T 5009.251996 1 主题内容与适用范围 1 主题内容与适用范围 本标准规定了大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种食品中杂色曲霉素的测定方法。本标准规定了大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种食品中杂色曲霉素的测定方法。本标准适用于大米、玉米、小麦、黄豆及花生等各种食品中杂色曲霉素的测定。本标准适用于大米、玉米、小
2、麦、黄豆及花生等各种食品中杂色曲霉素的测定。2 引用标准 2 引用标准 GB/T 5009.22 食品中黄曲霉毒素 BGB/T 5009.22 食品中黄曲霉毒素 B1的测定方法 3 原理 样品中的杂色曲霉素经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质，根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来测定样品中杂色曲霉素的含量。4 试剂 41 同 GB/T 5009.22 中 3.13.4。42 冰乙酸。43 甲酸。44 乙酸（95%）。45 氯化钠溶液（40 g/L）。46 三氯化铝-乙醇溶液（200 g/L）：称取 20 g 三氯化铝（AlCl36H2O）
3、溶于 100 mL 乙醇中，过滤，室温保存。47 杂色曲霉素标准使用液：用苯将 10 g/mL 的杂色曲霉素标准溶液稀释成每毫升相当于 1.0 和 0.40 g 的杂色曲霉素标准溶液。避光，放置于 4冰箱中保存。5 仪器 51 同 GB/T 5009.22 中 4.14.4。52 玻璃板：10 cm1的测定方法 3 原理 样品中的杂色曲霉素经提取、净化、浓缩、薄层展开后，用三氯化铝显色，再经加热产生一种在紫外光下显示黄色荧光的物质，根据其在薄层上显示的荧光最低检出量来测定样品中杂色曲霉素的含量。4 试剂 41 同 GB/T 5009.22 中 3.13.4。42 冰乙酸。43 甲酸。44 乙酸
4、（95%）。45 氯化钠溶液（40 g/L）。46 三氯化铝-乙醇溶液（200 g/L）：称取 20 g 三氯化铝（AlCl36H2O）溶于 100 mL 乙醇中，过滤，室温保存。47 杂色曲霉素标准使用液：用苯将 10 g/mL 的杂色曲霉素标准溶液稀释成每毫升相当于 1.0 和 0.40 g 的杂色曲霉素标准溶液。避光，放置于 4冰箱中保存。5 仪器 51 同 GB/T 5009.22 中 4.14.4。52 玻璃板：10 cm10 cm 与 10 cm10 cm 与 10 cm18.5 cm 两种。53 展开槽：内长 10 cm、宽 4.5 cm、高 17 cm 与内长 11.5 cm、
5、宽 60 cm、高 19 cm。54 玻璃喷雾器。55 空气泵或油泵。6 分析步骤 61 提取 611 大米、玉米、小麦、黄豆及花生：称取 20.00 g 过 20 目筛孔的大米、玉米、小麦及黄豆样品（花生样品过 10 目筛孔），置于具塞锥形瓶中，加 80 mL甲醇-氯化钠溶液（90+10），振荡 30 min，过滤。收集样品液 40 mL（黄豆、花生样品则取 20 mL，加入 20 mL 提取剂），移入 250 mL 分液漏斗中，再加入 25 mL氯化钠溶液（使甲醇与水之体积比为 55+45）和 25 mL 石油醚，振摇 2 min，静18.5 cm 两种。53 展开槽：内长 10 cm、宽
6、 4.5 cm、高 17 cm 与内长 11.5 cm、宽 60 cm、高 19 cm。54 玻璃喷雾器。55 空气泵或油泵。6 分析步骤 61 提取 611 大米、玉米、小麦、黄豆及花生：称取 20.00 g 过 20 目筛孔的大米、玉米、小麦及黄豆样品（花生样品过 10 目筛孔），置于具塞锥形瓶中，加 80 mL甲醇-氯化钠溶液（90+10），振荡 30 min，过滤。收集样品液 40 mL（黄豆、花生样品则取 20 mL，加入 20 mL 提取剂），移入 250 mL 分液漏斗中，再加入 25 mL氯化钠溶液（使甲醇与水之体积比为 55+45）和 25 mL 石油醚，振摇 2 min，静
7、中华人民共和国卫生部 19960619 批准 19960901 实施 中华人民共和国卫生部 19960619 批准 19960901 实施 GB/T 5009.251996 置分层。上层石油醚溶液置锥形瓶中，下层溶液仍移入原分液漏斗中，再用 25 mL石油醚提取一次。最后将两次上层的石油醚溶液合并，加入 25 mL 甲醇-氯化钠溶液（55+45）黄豆、花生样品则加入 25 mL 甲醇-氯化钠溶液（70+30），振摇 30 s，将下层并于原甲醇水层中，重复用甲醇-氯化钠溶液（55+45）提取两次黄豆、花生样品重复用甲醇-氯化钠溶液（70+30）提取一次，以提取该层的杂色曲霉素。下层溶液合并后加
8、30 mL 三氯甲烷（黄豆、花生样品除加三氯甲烷外，再加 13 mL 氯化钠溶液，使甲醇与水的体积比为 55+45），振摇 2 min，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层溶液经放有约 10 g 无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于蒸发皿中。于分液漏斗中再加 10 mL 三氯甲烷，重复提取一次，将该下层溶液和用少量三氯甲烷洗滤器的洗液一并放入蒸发皿中。将蒸发皿放置于 65水浴上挥干，然后再在冰浴上放置 23 min，加 1.0 mL 苯将残留物充分混匀，置入小试管中。或将以上蒸发皿中残留物用三氯甲烷移于浓缩管中，于 65用减压吹气法浓缩至干，加入 1.0 mL 苯，供色谱测定此 1 mL大米、
9、玉米及小麦样液各相当于 10 g 样品，1 mL 黄豆与花生样液则各相当于 5 g 样品。置分层。上层石油醚溶液置锥形瓶中，下层溶液仍移入原分液漏斗中，再用 25 mL石油醚提取一次。最后将两次上层的石油醚溶液合并，加入 25 mL 甲醇-氯化钠溶液（55+45）黄豆、花生样品则加入 25 mL 甲醇-氯化钠溶液（70+30），振摇 30 s，将下层并于原甲醇水层中，重复用甲醇-氯化钠溶液（55+45）提取两次黄豆、花生样品重复用甲醇-氯化钠溶液（70+30）提取一次，以提取该层的杂色曲霉素。下层溶液合并后加 30 mL 三氯甲烷（黄豆、花生样品除加三氯甲烷外，再加 13 mL 氯化钠溶液，使
10、甲醇与水的体积比为 55+45），振摇 2 min，静置。待上层混浊液有部分澄清时，即可将下层溶液经放有约 10 g 无水硫酸钠的定量慢速滤纸过滤于蒸发皿中。于分液漏斗中再加 10 mL 三氯甲烷，重复提取一次，将该下层溶液和用少量三氯甲烷洗滤器的洗液一并放入蒸发皿中。将蒸发皿放置于 65水浴上挥干，然后再在冰浴上放置 23 min，加 1.0 mL 苯将残留物充分混匀，置入小试管中。或将以上蒸发皿中残留物用三氯甲烷移于浓缩管中，于 65用减压吹气法浓缩至干，加入 1.0 mL 苯，供色谱测定此 1 mL大米、玉米及小麦样液各相当于 10 g 样品，1 mL 黄豆与花生样液则各相当于 5 g
11、样品。62 测定 62 测定 621 薄层板的制备：制备方法同 GB/T 5009.22 中 5.3.1.1，一般用 5 g 硅胶 G 可制成 10 cm621 薄层板的制备：制备方法同 GB/T 5009.22 中 5.3.1.1，一般用 5 g 硅胶 G 可制成 10 cm10 cm，厚度 0.3 mm 的薄层板五块。10 cm，厚度 0.3 mm 的薄层板五块。622 点样：取两块 10 cm10 cm 薄层板，在距板下端各 0.81 cm 基线上滴加标准使用液与样液如下：距左边缘 0.81 cm 处各滴加 10 L 标准使用液（0.4 g/mL），在距左边缘 4 cm 处各滴加 80
12、L 样液（黄豆、花生样品为40 L），然后在第二块板的样液点上加滴 10 L 标准使用液（0.4 g/mL），在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。622 点样：取两块 10 cm10 cm 薄层板，在距板下端各 0.81 cm 基线上滴加标准使用液与样液如下：距左边缘 0.81 cm 处各滴加 10 L 标准使用液（0.4 g/mL），在距左边缘 4 cm 处各滴加 80 L 样液（黄豆、花生样品为40 L），然后在第二块板的样液点上加滴 10 L 标准使用液（0.4 g/mL），在滴加样液时可用吹风机冷风边吹边加。623 展开：623 展开：6231 横向展开：展开剂是乙醚-正己烷-苯-三氯
13、甲烷-甲酸（3+9+1.5+1.5+0.6）15.6 mL（由于此混合液不成一相，每一展开槽的用量须单独配制）。用前充分摇匀，一并倒入槽内使用。将靠近标准点的一边，放入槽内展至 9 cm 左右取出挥干。6231 横向展开：展开剂是乙醚-正己烷-苯-三氯甲烷-甲酸（3+9+1.5+1.5+0.6）15.6 mL（由于此混合液不成一相，每一展开槽的用量须单独配制）。用前充分摇匀，一并倒入槽内使用。将靠近标准点的一边，放入槽内展至 9 cm 左右取出挥干。6232 纵向展开：展开剂为苯-甲醇-冰乙酸（90+8+2 或 92.5+6+1.5）15 mL。将靠近标准点与样液点的一边放入槽内，展开 9 c
14、m 左右取出挥干。6232 纵向展开：展开剂为苯-甲醇-冰乙酸（90+8+2 或 92.5+6+1.5）15 mL。将靠近标准点与样液点的一边放入槽内，展开 9 cm 左右取出挥干。624 显荧光：在薄层板上喷三氯化铝-乙醇溶液（200 g/L），置 80加热10 min，立即在紫外光灯（波长 365 nm）下观察结果，待薄层板冷却后再薄薄的喷第二次（不需加热），可直接观察结果。624 显荧光：在薄层板上喷三氯化铝-乙醇溶液（200 g/L），置 80加热10 min，立即在紫外光灯（波长 365 nm）下观察结果，待薄层板冷却后再薄薄的喷第二次（不需加热），可直接观察结果。625 观察与评定
15、结果：在紫外光灯下观察，若第二板的第二点在标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板的相同位置上未出现荧光点，则样品中杂色曲霉素含量在 5 g/kg（黄豆、花生样品为 20 g/kg）；若出现荧光强度与标准点的最低检出量的荧光强度相等，而且此荧光点又同第二板样液的标准点相重叠，则样品中杂色曲霉素含量为 5 g/kg（黄豆、花生样品为 20 g/kg）；若出现荧光强度比标准点的最低检出量强，则根据其荧光强度估计减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。在喷三氯化铝第一、二次后分别进行观察评定，两次结果应一致。若结果为阳性，则将薄层板放暗处
16、10 min，再观察一次，如样品仍为阳性，进一步作确证试验，即在距薄层板（10 cm18.5 cm）下端 3 cm 的基线上滴加一个点的 10 L 标准使用液（0.4 g/mL）与 3 个点的样液，每点625 观察与评定结果：在紫外光灯下观察，若第二板的第二点在标准点的相应处出现最低检出量，而在第一板的相同位置上未出现荧光点，则样品中杂色曲霉素含量在 5 g/kg（黄豆、花生样品为 20 g/kg）；若出现荧光强度与标准点的最低检出量的荧光强度相等，而且此荧光点又同第二板样液的标准点相重叠，则样品中杂色曲霉素含量为 5 g/kg（黄豆、花生样品为 20 g/kg）；若出现荧光强度比标准点的最低检出量强，则根据其荧光强度估计减少滴加微升数，或将样液稀释后再滴加不同微升数，直至样液点的荧光强度与最低检出量的荧光强度一致为止。在喷三氯化铝第一、二次后分别进行观察评定，两次结果应一致。若结果为阳性，则将薄层板放暗处 10 min，再观察一次，如样品仍为阳性，进一步作确证试验，即在距薄层板（10 cm18.5 cm）下端 3 cm 的基线上滴加一个点的 10 L 标准使用液（0.4 g/mL）与