1、SN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 2 9 5 一 9 3出口禽肉中杆菌肤残留量检验方法 杯碟法M e t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f b a c i t r a c i n r e s i d u e s i n p o u l t r y me a t f o r e x p o r t -C y l i n d e r-p l a t e m e t h o d1 9 9 3 一 1 2 一 2 8 发布1 9 9 4 一 0 5 一 0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发布中华人民共和国进出口
2、商品检验行业标准出口 禽肉中 杆菌肤残留量检验方法 杯碟法S N 0 295 一 93M e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t io n o f b a c i t r a c i n r e s i d u e s i n p o u l t r y m e a t f o r e x p o r t -Cy l i n d e r-p l a t e me t h o d主题内容与适用范围本标准规定了出口禽肉中杆菌肤残留量的抽样、制样和杯碟测定法。本标准适用于出口冻鸡中杆菌肤残留量的检验.引用标准S N 0 1 7 9 出口食品中四环素族抗生素
3、残留量检验方法抽样和制样3.1 检验批 以不超过 2 5 0 0 件商品为一检验批.同一检验批的商品应具有相同特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。3.2 抽样数量 批量，件最低抽样数，件 1 2 5 1 2 6 1 0 0 5 1 0 1 -2 5 0 1 0 2 5 1 5 0 0 1 5 5 0 1 -1 0 0 0 1 7 1 0 0 1 -2 5 0 0 2 03.3 抽样方法 按 3.2 规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品，原始样品总量不少于2 k g，放人清洁容器内，加封后，标明标记，及时 送交实 验室。3.4 样品制备 从每袋原始样品中取出部分有代表
4、性祥品，将可食部分放人绞碎机中绞碎均匀，充分混匀。用四分法缩分不少于 1 k g试样。装入清洁容器内，加封后，标明标记。I5 样品保存 将试样于一1 8 0C冷冻保存。注:在抽样及制样过程中 必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 3-1 2-2 8 批准1 9 9 4 一 0 5 一 0 1 实施 Is N 0 295 一 934 测定方法4.1 方法提要 用3 3%毗吮 溶液 提取试 样中 杆菌肤，将提取液再用甲 醉提取，经减 压浓缩至干，用磷酸盐 缓冲液溶解残留物，调整 p H后用杯碟法测定。4.2 设备和材料4.2.1 培养皿:内径 9
5、 0 mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，并应配有陶瓦盖。4.2.2 牛 津杯:外径7.8 4-0.1 m m，内 径6.0 士。.1 m m，高1 0 1 0.1 m m，不锈钢管。4.2.3 游标卡尺:测量范围。2 0 0 mm，精度。.0 2 m m，或使用抑菌圈测量仪测量。4.2.4 离心机:转速 3 0 0 0 r/mi n,4.2.5 旋转式真空浓缩器。4.2.6 恒温培养箱:3 6 士1 C。4-2.7 高压灭菌器，4.2.8 其他:玻璃板，吸管，滴管，茄形瓶等.4.3 试剂和培养基4.3.1 试剂4.3-1-1 毗陡:分析纯。4.3.1.2 毗吮溶液:3 3 Y.。取毗lt 3
6、 3 mL，用蒸馏水定容至 1 0 0 mL,4.3.1.3 甲醇:分析纯。4.3.1.4 磷酸盐缓冲液:5%,p H 6.5,称取2 2.1 5 g 无水磷酸氢二钾和2 7.8 5 g 无水磷酸二氢钾溶解干 蒸馏水中，定容至1 0 0 0 m L,4.3.15 氢氧化 钠溶液:1 m o l/L,4.3.1.6 磷酸盐缓冲湾:1%,p H 6.0,称取2.0 g 无水磷酸氢二钾和8.0 g 无水磷酸二氢钾溶解于蒸馏水中，定容至1 0 0 0 m L,4.3.1.7 杆菌肤标准品:5 8 I U/m g(卫生部药品 生物制品 检定所提供)。4.3.1.8 试验菌种:藤黄微球菌C Mi c r
7、o r o r c u s L u t e u s?,菌种号 2 8 0 0 8(卫生部药品生物制品检定所提供)。4.3.2 培养基4.3.2.1 增菌用培养基;见附录 A第Al 章。4.3-2.2 基层用培养基:见附录 A第A2 章。4.3-2.3 菌种层用培养基:见附录A第A3 章。4.4 测定步骤4.4.1 工作液制备4.4.1.1 杆菌肤标准贮备液 准 确称 取适量的杆菌肤标准品，用1 0 o p H 6.0 磷酸盐缓冲液配制成1 0 0 l U/m L的 标准贮备液，于冰箱中保存，可使用一周。4.4-1.2 杆菌肤标准工作液 吸取一定量杆菌肤标准贮备液，用1%p H 6.0 磷酸盐缓
8、冲 液稀释成0.1 5 和0.6 I U/m i的工作标准液，以 及。0 2 5,0.0 5 0,0.1 0 0,0 2 0 0,0.4 0 0,0.8 0 0 I U/m L的稀释液，作为制备标准曲线的标准浓度溶液，0.1 0 0 I U/m L 的稀释液为 参考浓度溶液。以 上稀释液均须当日 配制。4.4.1.3 菌种培养及菌液的制备 将试验菌种安瓶瓶上部消毒后敲碎，加入少量增菌用培养基(4.3.2.1)溶解后，移入以上培养基中，混匀后于3 6 士1 培养 2 4 h，再转接至琼脂试管斜面(4.3.2-3)，培养 1 6 -1 8 h，然后加入适量生理盐 2S N 0 2 9 5 一 9
9、3水，将菌苔洗下，备用。4.4.2 试液制备:准确称取经绞碎混匀的试样1 0.0 g 于 均质 器内，加人1 7 m L 毗咤溶液(3 3 0 o)，均质3 m i n后，移入离心管中离心2 0 min(3 0 0 0 r/m i n)。取上清液 1 0 mL,置于另一个离心管内，加入3 0 m L甲 醇充分振摇2 m i n，再离心2 0 m i n(3 0 0 0 r/m i n)。将上清液移入茄形瓶中，减压 浓缩至干，加入3 m L磷酸盐缓冲液(5%)溶解即为样液.此样液中相当 于禽肉 试样浓度为1.9 6 g/m L.4.4.3测定4.4-3.1 平板制备 于无菌平皿中加入2 0 m
10、l,熔化的基层用培养基(4.3.2.2)，保持水平，待其凝固备用。然后，将锥形瓶中菌种层用培基(4.3.2.3)经熔化并冷却至 5 0 5 5 0C，加人适量的试验菌液(4.4.1.3)使之充分混合后，取 4 ml,注入上述基层培养基上 保持水平，待其凝固。在测定前应先用。.1 5 川/m L标准工作液对该菌液浓度的平板进行预测试，经培养后其标准工作液所呈现的抑菌圈直径在1 0 mm以上，则该菌液浓度的平板即可使用，否则须调整其菌液浓度，制成合于检定用的平板。4.4.3.2 标准曲线的制备 可参 照S N 0 1 7 9-9 2 中 的6.14.4-3.3 检测 每个样品用三个检定平板，在每个
11、平板上，如不需定量时，置 4只消毒的牛津杯，对角 2只注满样液，剩余的 2 只杯里分别注满0.6 I U/mL和。.1 5 I U/m L杯菌肤标准工作液;如需定量时，须置6只消毒的牛津杯，间隔注满样液和。.1 I U/mL杆菌肤标准工作液，于3 6 士1 培养 1 7 士1 h o4.5 结果计算和表述4.5.1 结果计算和表述 在三个检定平板上，如样液呈出与。.6I U/m L和 0.1 5 I U/mL标准工作液相同的清晰抑菌圈时，可用游标卡尺或测量仪进行测量，其抑菌圈平均直径在 1 0 mm以上者为阳性。对于需定量的实验结果，将分别算出三个检定平板上。.II U/m L和样液的抑菌圈直
12、径的平均值，经校正后，于标准曲线上查出其抑菌圈直径的平均值所对应的标准浓度值，通过式(1)计算可得出祥品中抗生素的含量:(1)c-阴 -X式中:X 样品中杆菌肤的含量,I U/g;c 从标准曲线上查出祥液所对应的抗生素浓度，I U/mL;m 最终试液所代表的禽肉试样的 浓度，g/m L,4.5.2 结果换算 如果样品中杆菌肤含量的单位 要采用m g/k g 表示时，可将I U/g 按照下述方法进行 换算:标准品中 杆菌肤含量=A I U/m g 样品中杆菌肤含量=B I U/g1 I U=1/A m g 二1/AX1 0 j g(2)B I U/g=B/AX 1 0 j g/g=B/AX 1
13、0 mg/k g 。(3)式中:A标准品中杆菌肤含量的数值;B 依据式(1)计算所得到的样品中杆菌肤的数值。S N 0 2 9 5 一9 3测定低限、回收率测定低限本方法测定低限为。.0 2 5 I U/g,回收率回 收率的 数据:杆菌肤添加 浓度在。.0 2 5 0.1 0 0 I U/g 范围内，回收 率为7 4.8 0 0 1 0 8.8 0 x,s N 02 95 一 9 3 附录A培养墓成分及制备方法 (补充件)A l 增菌用培养墓 蛋白 陈1 0.0 g 牛肉 浸膏5.0 g 氯 化钠2.5 9 蒸馏水1 0 0 0 mL 将上述各成分于蒸馏水中加热溶解，用 1 mo l/L氢氧化
14、钠溶液或 1 0%盐酸调节 p H，使其灭菌后p H为 7.0 士。.1，分装于小试管中，每管约3 m L，于 1 2 1 0C1 5 m i n高压灭菌。A 2 基层用 培养墓 蛋白 陈6.0 9 牛肉 浸膏1.5 g 醉母浸膏3.0 g 琼脂1 5.0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 将上述各成分于蒸馏水中加热溶解，用 1 m o l/L氢氧化钠溶液或 1 0%盐酸调节 p H，使其灭菌后p H为6.5 士0.1，分装于锥形瓶内，于 1 2 1 0C 1 5 mi n高压灭菌，备用。A 3 菌种层用培养 墓 蛋白 陈6.0 g 牛肉浸 膏1.5 9 酵母浸膏3.0 g 葡萄糖1.0 9
15、胰酪蛋白4.0 g 琼脂1 5.0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 将上述各成分于蒸馏水中 加热溶解，用1 m o l/L氢氧化钠溶液或1 0%盐酸调节p H，使其灭菌后p H为6.5 士。.1，分装于锥形瓶和大试管内，于1 2 1 0C 1 5 m i n 高压灭 菌。灭菌后将 试管制备成所需斜面备 用。S N 0 2 9 5 一 9 3 附录B检 验 程 序 图 (补充件)标准 贮 备液试 验 菌 培养于均质杯内加入1 7 m L 3 3%毗 咤移入离心管离心2 0 m i n(3 O O O r/m i n)标 准工 作 液菌 液 制 备取上清液(l O mL)加入 3 0 m L甲醉
16、振 摇 2 m i n检 定 用平 板 制 备离心2 0 mi n制 备 标 准 曲线取 上 清液 入 茄 形 瓶蒸 干加入 3 ml.5%碑酸 盐 缓 冲液样 液(P H 6.5)检 测结果计算和表述附加说明:本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草;本标准主要起草人袁而森、王素琴、李剑影。本 标准等同采用日 本厚生省检验 方法，畜水产 食品中内 残留物质检查法(1 9 9 0),P r o f e s s i o n a l S t a n d a r d o f t h e P e o p l e s R e p u b l i c o f C h i n a f o r I mp o r t a n d E x p o r t C o mm o d i t y I n s p e c t i o nS N 0 295 一 9 3M e t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f b a c i t r a c i n r e s i d u e s i n p o u