1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准?代替?和?进出口食品中大肠菌群?粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法?发布?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法、出口食品中大肠杆菌（葡萄糖苷酶荧光）检验方法 和 进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜法。本标准与 、和 相比，主要技术变化如下：将原标准名称 出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法、出口食品中大肠杆菌（葡萄糖苷酶荧光）检验方法 和 进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜法 整合修订为 进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆
2、菌检测方法；标准的范围不变，但 和 标准的范围有限，因此，本标准将范围进行整合修订；增加了规范性引用文件；增加了术语和定义；在设备和材料中删掉了乳钵和研棒，稀释瓶中增加了“其他适宜的容器”；对液体样品 法的检测修订为：液体样品接种量 以上者，用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤；接种量及以下者，则用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤；平板计数法中删去了计算公式；值表增加了“置信区间”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：付宝莲、刘中学、侯丽萍、高飞。本
3、标准所代替标准的历次版本发布情况为：；。犛 犖犜 进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法范围本标准规定了进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检测方法。本标准中 法适用于进出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验；平板计数法适用于进出口食品中大肠菌群的检验；葡萄糖苷酶荧光法适用于进出口食品（不包括贝类）中大肠杆菌的检验；滤膜法适用于进出口方便面、膨化食品、矿泉水、饮料、牛奶（需用蛋白酶处理）、单晶糖和椒粒中大肠菌群和大肠杆菌的检验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括
4、所有的修改单）适用于本文件。培养基制备指南第部分：实验室培养基制备质量保证通则 培养基制备指南第部分：培养基性能测试实用指南术语和定义下列术语和定义适用于本文件。大肠菌群 犮 狅 犾 犻 犳 狅 狉 犿需氧及兼性厌氧，能在 分解乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。粪大肠菌群 犳 犲 犮 犪 犾 犮 狅 犾 犻 犳 狅 狉 犿需氧及兼性厌氧，能在 ，发酵乳糖产酸产气的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌又可称耐热大肠菌群（）。大肠杆菌犈 狊 犮 犺 犲 狉 犻 犮 犺 犻 犪 犮 狅 犾 犻需氧及兼性厌氧，能在 分解乳糖产酸产气，生化特征“”为“或”的一群革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌又可称大肠埃希氏
5、菌。检验方法 原理 最可能近似值（犿 狅 狊 狋狆 狉 狅 犫 犪 犫 犾 犲狀 狌 犿 犫 犲 狉，犕犘 犖）法 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出大肠菌群、粪大肠菌群或大肠杆菌在犛 犖犜 待测样品中的最大可能数。平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。葡萄糖苷酶荧光法大肠杆菌中的葡萄糖苷酶可降解培养基中 甲基伞形酮 葡萄糖苷酸（），并释放 甲基伞形酮荧光物质（），该物质在紫外灯（波长 ）下会显现蓝色荧光特点。滤膜犕犝
6、犌法待测样品通过滤膜过滤时，样品中的大肠菌群和大肠杆菌被截留于滤膜表面。将滤膜贴附于或琼脂上培养后，大肠菌群在琼脂上会形成蓝色菌落；而琼脂上的大肠杆菌由于葡萄糖苷降解 甲基伞形酮 葡萄糖苷酸（）并释放 甲基伞形酮，形成紫外光（）下为蓝白色荧光的菌落。培养基与试剂 生理盐水：见附录。氏磷酸盐缓冲稀释液：见附录。月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（）：见附录。煌绿乳糖胆盐肉汤（）：见附录。大肠杆菌肉汤（）：见附录第。伊红美蓝琼脂（）：见附录。结晶紫中性红胆盐琼脂（）：见附录。月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（）：见附录。：见附录。蛋白胨吐温 稀释液（）：见附录 。乳糖莫能菌素葡萄糖酸琼脂（）：见附录 。缓冲琼脂（）
7、：见附录 。三（羟甲基）胺甲烷（）缓冲剂：见附录 。营养琼脂斜面：见附录 。色氨酸肉汤：见附录 。培养基：见附录 。氏枸椽酸盐肉汤：见附录 。氏靛基质试剂：见附录 。甲基红指示剂：见附录 。试剂（）：见附录 。革兰氏染色液：见附录 。胰蛋白酶贮存液：见附录 。设备与材料 培养箱：，。水浴箱：，。犛 犖犜 冰箱：和 。均质器：涡旋式或拍击式。吸管：，具 刻度；和，具刻度。平皿：直径。试管：。稀释瓶：三角烧瓶、广口瓶或其他适宜的容器。玻璃小倒管：长度约。天平：感量。显微镜。菌落计数器。滤器：备预滤器。滤膜：有机或水相，孔径 。真空泵。紫外灯：波长 。样品制备 固体或半固体样品无菌操作称取样品 置于
8、装有 灭菌稀释剂（）的适宜容器中，充分振摇、混匀。或将剪碎后的试样 置于灭菌的均质杯袋内，加入 灭菌稀释剂，以 涡旋式均质 ，或以次 次拍击式均质 ，制成 的样品稀释液备用。液体样品以无菌吸管吸取样品 置于装有 灭菌稀释剂的适宜容器中，以 幅度于 内振摇 次或机械振荡器中振摇。制成 的样品稀释液备用。样品稀释样品稀释液的 值应在 之间，值过低或过高时可分别用 氢氧化钠或 盐酸予以调节。根据对样品污染情况的估计，将 或 制成的 样品稀释液用灭菌稀释剂进行系列十倍递增稀释，如，直至最高稀释度的检测结果达到阴性终点。每一稀释度换用支 无菌吸管或移液器吸头，上一稀释度用的吸管或吸头不要触及下一稀释度的
9、稀释液。从制备样品稀释液至稀释完毕，全过程不得超过 。样品的酶处理 一般要求样品的酶处理可在室温下（）进行。固体或半固体样品无菌操作称取样品 置于装有 灭菌 稀释液（）的适宜容器中，充分振摇、混匀。或将剪碎后的试样 置于灭菌的均质杯袋内，加入 灭菌稀释剂，以 涡旋式均质 ，或以次次拍击式均质 ，制成 的样品稀释液备用。犛 犖犜 液体样品以无菌吸管吸取样品 置于装有 灭菌 稀释液的适宜容器中，以 幅度于内振摇 次或机械振荡器中振摇。制成 的样品稀释液备用。样品稀释取 的酶 稀释液（胰蛋白酶贮存液：稀释液）于 或 制成的 样品稀释液中并混匀，置于 水浴中处理 后，将制成的 样品酶处理稀释液用灭菌
10、稀释液进行系列十倍递增稀释，如，直至最高稀释度的检测结果达到阴性终点。每一稀释度换用支无菌吸管或移液器吸头，上一稀释度用的吸管或吸头不要触及下一稀释度的稀释液。从制备样品稀释液至稀释完毕，全过程不得超过 。样品过滤将灭菌过滤装置连接于真空抽滤瓶上，以无菌操作将无菌滤膜放在抽滤底座上并固定。无菌操作加入 无菌蒸馏水于滤器中，打开真空泵，抽吸过滤，再从 中选取适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度分别过滤，每次。最后再加入 无菌蒸馏水，抽吸过滤后，关闭真空泵，用无菌镊子将滤膜取出于 中备用。大肠菌群的测定 犕犘 犖法 从 中选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度均接种三管月桂基硫酸
11、盐胰蛋白胨（）肉汤，每管接种。液体样品接种量以上者，用双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤；接种量及 以下者，则用单料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤。培养 后，观察倒管内是否有气泡产生，并记录 和 内产气的 肉汤管数。对未产气管有疑问时，可以轻敲试管壁的方式观察是否有较细小的气泡从管底逸出，如所有 肉汤管均未产气，可按 报告结果；如 肉汤管有产气，则按 作证实试验。证实试验。用直径的接种环从 中所有 和 内发酵产气的 肉汤管中分别挑取培养液环，分别移种于煌绿乳糖胆盐（）肉汤管中，于 培养，记录所有 肉汤管的产气管数，根据 肉汤的产气管数查 表（见附录）并按 报告结果。平板计数法 从 中选取适宜的三个连续稀释
12、度的样品稀释液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿。另取稀释剂加入一灭菌平皿中，作空白对照。将冷至 的结晶紫中性红胆盐琼脂（）约 倾注于每个平皿中，小心旋转平皿，使培养基与样液充分混匀。待琼脂凝固后，再加的 均匀覆盖于平板表层，凝固后翻转平皿，培养 。选取菌落数在 个 个之间的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型大肠菌群菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径约 或更大。典型和可疑菌落按 作证实试验。证实试验。用接种环从 平板上挑取 个不同类型的典型或可疑菌落，移种于 肉汤管内，培养 后观察产气情况。对 肉汤产气者按 计算；对形成犛 犖犜 菌膜的阳性管则应进行革兰氏染色，以便排
13、除革兰氏阳性杆菌。将 中证实为大肠菌群阳性的菌落数相加，再乘以稀释倍数，按 报告结果。滤膜犕犝 犌法以无菌操作将 样品过滤后的滤膜贴放于预先干燥的琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。于 培养 后，选取菌落数在 个 个之间的平板，计数所有蓝色（包括深蓝或浅蓝色）菌落。将滤膜上的菌落数相加，再乘以其稀释倍数，按 报告结果。粪大肠菌群犕犘 犖法的测定用直径为的接种环从 中所有 内发酵产气的 肉汤管中分别挑取培养液环，转种于 肉汤管中并放置于带盖的 恒温水浴箱内，培养。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。记录 肉汤管的产气情况，产气管为粪大肠菌群阳性；不产气为粪大肠菌群阴性。根据粪大肠菌群的阳
14、性管数查 表（见附录）并按 报告结果。大肠杆菌的测定 犕犘 犖法 培养将 中 肉汤管在 恒温水浴箱内继续培养 后，从产气管中挑取培养液划线接种于伊红美蓝（）平板，培养。检查检查平板上有无黑色中心、有光泽或无光泽的可疑菌落。用接种针蘸取菌落中心部位并转种于营养琼脂斜面上，培养 。试验 将营养琼脂斜面培养物转种于下列生化培养基中进行试验。色氨酸肉汤：培养 后，加 氏试剂 ，上层出现红色者为靛基质试验阳性。培养基：培养 后，无菌操作移取培养物至 试管中，加 萘酚乙醇溶液 ，氢氧化钾溶液 和少许肌酸结晶，振摇试管后静置，如出现伊红色，为 试验阳性。将 培养物的剩余部分继续培养 后滴加滴甲基红溶液，如培
15、养物变红则表示甲基红试验阳性；若变黄则甲基红试验阴性。氏柠檬酸盐肉汤：培养 后，观察其生长情况。肉汤：培养 后，观察其产气情况。革兰氏染色：取营养琼脂斜面培养物进行革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌。大肠杆菌和非大肠杆菌生化鉴别如下表，如出现表中以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。犛 犖犜 表大肠杆菌和非大肠杆菌生化鉴别表靛基质 柠檬酸盐鉴定（型别）典型大肠杆菌非典型大肠杆菌典型中间型非典型中间型典型产气肠杆菌非典型产气肠杆菌 大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，试验为或。根据 肉汤阳性管数查 表（见附录）并按 报告结果。葡萄糖苷酶荧
16、光法 从 中选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度均接种三管 肉汤，每管。于 内置于 水浴或培养箱内培养。将培养后的 肉汤管拿至暗室，在长波紫外光灯（波长 ）下观察。产气显蓝色荧光的为大肠杆菌阳性；产气不显蓝色荧光的按 作证实试验。证实试验：从 中产气不显蓝色荧光的 肉汤管中挑取培养物，划线接种于 琼脂平板，于 培养。将培养后的 平板拿至暗室，在长波紫外光灯（波长 ）下观察，凡显蓝色荧光的菌落均为大肠杆菌阳性菌落。根据 中 肉汤阳性管数，和 中 琼脂平板证实为大肠杆菌阳性的 肉汤阳性管数查 表（见附录）并按 报告结果。滤膜犕犝 犌法以无菌操作将 样品过滤后的滤膜贴放于预先干燥的琼脂平板表面上，滤膜与琼脂表面之间应无气泡。放入 培养箱中培养，在暗室或紫外操作室内用波长 灯观察滤膜上的菌落是否有蓝白色荧光。选用菌落数范围在 个 个之间的平板，计算蓝白色荧光的菌落数并相加，再乘以其稀释倍数后，按 报告结果。报告结果 犕犘 犖法每克（毫升）样品中大肠菌群、粪大肠菌群或大肠杆菌的 值（或）。平板计数法每克（毫升）样品中大肠菌群数（或 ）。葡萄糖苷酶荧光法每克（毫升）样品中大肠杆菌的 值