1、SN中华人民共和国进出口商品检验行业标准s N 0 6 7 2 一 1 9 9 7出口肉及肉制口口 D检验方法中己烯雌酚残留量放射免疫法Me t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f d i e t h y l s t i l b e s t r o l r e s i d u e s i n me a t s a n d m e a t p r o d u c t s f o r e x p o r t -R a d i o i mmu n o a s s a y1 9 9 7 一 0 8 门 5 发布1 9 9 8 一 0 1 一
2、0 1 实施中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布S N 0 6 7 2 一 1 9 9 7前言 本标准 是根据G B/T 1.1-1 9 9 3 标准 化工作导则 第1 单元:标准的起草与表述规则 第1 部分:标准编写的基本规定 及S N/T 0 0 0 1-1 9 9 5 出口 商品中农药、兽药残留 量及生物毒素 检验方法标准编写的 基本规定 的要求而进行编写的。其中测定方法是在原科研成果的 基础上，参照国内外有关资料，经改进并验证后制定的。本标准同时制定了抽样和制样方法。测定低限是根据国际 上对肉品中己 烯雌酚残留 量的最高限量和测定方法灵敏度制定的。本标准由中 华人民 共和国国家进出
3、口 商品检验局提出并归口。本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草。本标准主要起草人:刘克、张凤才、李剑影、戚玉凤、俞润民。本标准系首次发布的行业标准。中 华人民共和国进出口 商品检验行业标准出口肉及肉制品检验方法中己烯雌酚残留量放射免疫法S N 06 72一 1 997Me t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f d i e t h y l s t i l b e s t r o l r e s i d u e s i n me a t s a n d me a t p r o d u c t s f o r e x p
4、o r t -Ra d i o i mmu n o a s s a y范围本标准规定了出口肉及肉制品中己烯雌酚残留量检验的抽样、制样和放射免疫测定方法。本标准适用于出口冻牛肉中己烯雌酚残留量的检验。2 抽样和制样2.飞 检验批 以不超过 2 5 0 0 件为一检验批。同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。2.2 抽样数量 批量，件最低抽样数，件 1-2 5 1 2 5-1 0 0 5 1 0 12 5 0 1 0 2 5 1-5 0 0 1 5 5 0 1 -1 0 0 0 1 7 1 0 0 1 -2 5 0 0 2 02.3 抽样方法 按2.2 规定的抽样件数
5、随机抽取，逐件开启。从每件中 至少取一袋作为原始样品。如每件中无小包装或有小包装，但每袋小包装重量超过2 k g 者，则可用灭菌刀具从每件中割取不少于1 0 0 g,混合 后置于清洁容器内，作为混合原始样品。混合原始样品的总量不少于2 k g。加封后，标明 标记，及时 送交实 验室。2.4 试样制备 从混合原始样品中取出部分有代表性样品，将可食部分放入绞碎机中绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于5 0 0 9，均分成两份，装入清洁容器内 作为 试样，加封并标明标记。2.5 试样保存 将试样于一1 8 以下冷冻保存。注:在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。中华人
6、民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 7-0 8-1 5 批准1 9 9 8 一 0 1 一 0 1 实施 Is N 0 6 7 2 一 1 9 9 7测定方法3.1 方法提要 试样中残留的己 烯雌酚，用乙 醚和氢氧化钠溶液依次提取。氢氧化钠提取液经用正己 烷抽去杂质并调整p,H后，再用乙醚提取、蒸干，最后用甲醇一 磷酸盐明胶缓冲液溶解残渣。加入己 烯雌酚氖标 记物及抗体，置4 静置后加分离剂，离心，取上清 液，用液体闪 烁分析仪进行测定。3.2 试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。3.2.1 磷 酸盐缓冲溶液:p H 7.2。取1.4 5 g 磷酸氢二钠(含 1 2 个
7、结晶水)、。1 g 磷酸二氢钾(无水)、8.0 g 氯化 钠，溶解于水中 并定容至1 0 0 0 m L,3.2.2 磷酸盐一 明 胶缓冲液:取1.0 g 明 胶用磷酸盐缓冲溶液溶解并稀释至1 0 0 0 m L,3.2.3 活性炭:6 0目。3.2.4 葡聚糖:G2 0 0,3.2.5 分离剂(活 性炭一 葡聚糖溶液):取1 0 0 m g 葡聚 糖，溶解于1 0 0 m L 磷酸盐一 明胶缓冲液中，然后加1 g 活 性炭，电 磁搅拌1 h，置于锥形瓶中 于4 保存。临测定前用磷酸盐一 明胶缓冲液稀释4 倍。3.2.6 氢氧化钠溶液:。.1 m o l/L,3.2.7 无水乙醚。3.2-8
8、三氯甲烷。3.2.9 正己烷。3.2-1 0 磷酸溶液:磷酸(8 5%)+水(1+1),3.2-1 1 甲醇一 磷酸盐一 明胶缓冲液:甲醇十磷酸盐一 明胶缓冲液(1 十4),3.2.1 2 2,5 一 二苯基of u,.3.2.1 3 1,4 一 双 2 -(4 一 甲基一 5 一 苯基嗯哇)P E W 一 苯。3.2-1 4 闪烁液:取4 g 2,5 一 二苯基A,A K 和。2 g 1,4 一 双 2 一(4 一 甲 基一 5，一 苯基p a,)一 苯，溶于1 0 0 0 m L二甲苯中，充分混匀，置于棕色瓶内，静置 3日后使用。3 2.1 5 己 烯雌酚标准品:纯度)9 9 o o(U
9、S A S ig m a 公司提供或相当 者)。3.2-1 6 己烯雌酚标准贮备液:准确称取 1 0 mg己烯雌酚标准品，置于 1 0 0 m L容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，作为标准贮备液(每 毫升 含己烯雌酚0.1 m g)，密封保存。3.2.1 7 己 烯雌酚标准工作液:临测定前，精确移取适量的己 烯雌酚标准贮备液，用甲醇 一 磷酸盐一 明 胶缓冲 溶液稀释成浓度为1 2.5,2 5,5 0,1 0 0,2 0 0,4 0 0 p g/1 0 0 IA L 的标准工作液，用以制备标准曲线。3.2-1 8 己烯雌酚抗体(D E S-A b):每瓶含0.0 5 m L(真空冻干)D E S
10、-A b抗血清(C E N T R C D E R E C H-E R R OU S S E L L I C C A F制品或相当者)。3.2.1 9 已烯雌酚抗体工作液:取己烯雌酚抗体 1 瓶加入 1 0 mL磷酸盐缓冲溶液使其完全溶解，该工作液置 4 保存，有效期 7 天。3.2-2 0 己 烯雌酚A标记物(H-D E S):英国放化中心A m e r s h a m生产，或相当者。放射性浓度为3 7Mb q/m L,3.2-2 1 己烯雌酚氖标记物工作液:取己烯雌酚氖标记物，置固定的试剂瓶中，加人磷酸盐缓冲液稀释至放射性浓度为5 0 0 0 e p m/1 0 0 p L的己 烯雌酚氖标
11、记物工作液。33 仪器和设备331 液体闪 烁分析仪:仪器操作条件是机器 运行时，环境温度为1 5 3 0 C，相对湿度为3 0/8 0/,确定本仪器地点远离所有的放射源。3.3.2 绞碎机:电动。3.3.3 低温离心机:不低于 3 5 0 0 r/m i n,S N 067 2一 199 73.3.4 水浴锅:恒温温度(4 0 士1)C。3.3.5 电磁搅拌器。3.3.6 微量注射器:5 0 -2 0 0 p L,3.3了 低钾闪烁瓶。3.3.8 试管:7 5 m m X 1 6 m m，带磨口玻璃塞。3.4 测定步骤3.4.1 提取 称取4 g 试样(精确至。1 g)，置于试管中，加入1
12、0 m L 无水乙醚 振摇2 0 m i n 后，以3 5 0 0 r/m i n 离心3 m i n，将提取液转移至另 一干净试管中，重复上述操作一次。合并乙 醚提取液，于4 0 水浴中燕发至近干。用4 m L三氯甲 烷溶解残渣，然后加4 m L氢氧化钠溶液振摇2 m i n，静置分层后将氢氧化钠溶液层转移至另一干净试管内，重复上述操作一次。合并氢氧化钠溶液层。加人8 m L正己 烷，剧烈振摇，待分层后弃去正己 烷层。用磷 酸溶液调整溶 液p H至7.0。每次用8 m L无水乙醚提取两 次，合并乙醚层并蒸发至近 干。用1 m L甲 醇 一 磷酸盐 一 明 胶缓冲液溶解残留物，溶 液供液体闪
13、烁分析仪测定。3.4.2 标准曲 线的绘制 取1 8 只 试管并编号，按下 述操作 过程制备。1 号、2 号管作为测 量总T数用。分别依次加入1 2 0 0 p L 磷酸盐一 明 胶缓冲液和1 0 0 p L己 烯雌酚氖标记物工作液(3.2.2 1)后，于 4 C 静置 1 2 h,3 号、4 号管作为测量非 特异结合 率(N S B)用。分别依次加入7 0 0 p L 磷酸盐一 明 胶缓冲液和1 0 0 p L己 烯雌酚氖标 记物工作 液(3.2.2 1)后，于4 静置 1 2 h，加人5 0 0 I L 分离剂。5 号、6 号管作为测量特异结合率(凡)用。分别依次加入6 0 0 p L 磷
14、酸盐一 明 胶缓冲液、1 0 0 p L D E S-A b 抗血清和1 0 0 p L己 烯雌酚氖标记物工作液(3.2.2 1)后，于4 C 静置1 2 h，加入5 0 0 p L 分离剂。7 1 8 号管作为标准溶液用。选1 2,5,2 5,5 0,1 0 0,2 0 0,4 0 0 p g/1 0 0 M L六 个浓度标 准工作液，每个浓度用两管。分别依次加人5 0 0 p L 磷酸盐一 明 胶缓冲 液、1 0 0 p L标准溶液,1 0 0 p L D E S-A b 抗体和1 0 0 p L己烯雌酚氖标记物工作液(3.2.2 1)后，于 4 C静置 1 2h，加入 5 0 0 p L
15、分离剂。以上各管静置3 0 m i n 后以3 5 0 0 r/m i n 离心2 0 m i n,吸取每管全部上清液，放入闪烁瓶内，加入1 0 m L 闪烁液，静 置3 h 后，在液体闪 烁分析仪上测定放 射性计数。总T表示标记物在本次实验中的浓度，该浓度应和样液中 被测物浓度保 持同 一水平，如偏离太远，应适当调节试液浓度。按式(1)计算 B I B。值:BI Bo B 一 N SB一B。一NS BX 1 0 0，。，(1)式中:B I B o 结合率，%;B 标准工作液各浓度双管计数均值;玩 特异结合双管(即5 号、6 号管)计数均值;N S B 非特异结合双管(即 3 号、4 号管)计
16、数均值。求得B I B o(写)值后，以此为纵坐标，各标准工作液浓度为 横坐标，在半对数坐标纸上绘制标准曲线、3.4.3 样液测定 取2 只试管，于每只 试管中分别加入5 0 0 p L 磷酸盐一 明 胶缓冲液,1 0 D p L 最终样液,1 0 0 p L D E S-A b 抗体及1 0 0 p L己 烯雌酚氖标记物工作液(3.2.2 1)后，于4 C 静置 1 2 h，加入5 0 0 p L 分离剂，以下操作 方法与 制作标准曲线相同。根据液 体闪烁分析仪测定的数据，求得B/B o(姚)值，再从标准曲线上查出样液中己烯雌酚的浓度。3.4.4 空白试验S N 0 67 2一 1 99 7使用经脱激素肉样，按上述测定步骤进行操作。结果计算和表述按式(2)计算试样中己 烯雌酚残留含量:X=c I 二二。.。.一(2)式中:X试样中己烯雌酚残留含量，le g/k g;从标准曲 线上查得样液中己 烯雌酚浓度，n g/m L;V 样液最终体积，m L;次 所称试样量，g=注:计算结果应扣除空白值.测定低限、回收率1 测定低限 本方法的测定低限为。0 5 t g/k g o2回收率 牛肉中己