1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犘 犲 狀 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犮 犺 狉 狔 狊 狅 犵 犲 狀 狌 犿，犃 狊 狆 犲 狉 犵 犻 犾 犾 狌 狊犪 狀 犱狉 犲 犾 犪 狋 犲 犱狋 狅 狓 犻 狀犻 狀犳 狅 狅 犱 狊 狋 狌 犳 犳 犳 狅 狉 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准代替 进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的
2、检测方法。本标准与 相比，主要技术变化如下：将中文名称改为 进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法。增加了附录培养基与试剂。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国齐齐哈尔出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘伟、张宏伟、马旭、侯丽萍、张海英、蔡国瑞、贺艳、庞春贤、曲鹏。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：。犛 犖犜 进出口食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测方法范围本标准规定了食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检验方法。本标准适用于食品中产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检验。规范性引用文件下列文件对于本文件的应
3、用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。食品卫生微生物学检验常见产毒霉菌的鉴定 （所有部分）培养基制备指南试样的制备和保存 试样制备从原始样品中取出部分有代表性的样品，将可食部分用绞碎机绞碎，充分混匀。用四分法缩分出不少于 ，作为试样。装入清洁容器内，加封并表明标记。试样保存将试样于 以下冷冻保存。在抽样及制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。测定方法 方法提要以无菌操作称取有代表性的样品，然后进行微生物培养，按照 中检索表进行镜检、鉴定，对可疑的真菌进行产毒培养，用标准菌株检测
4、培养液是否存在毒素，从而得到定性的结果。检验流程参见附录。材料和设备 试管：直径，长 。吸管：和 。离心机：犵。振荡器。培养皿：内径。载玻片和盖玻片。形玻璃棒。犛 犖犜 定性滤纸。牛津杯：外径 ，内径 ，高 。毛细管。游标卡尺。显微镜。标准菌株：巨大芽孢杆菌（犅 犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊犿 犲 犵 犪 狋 犺 犲 狉 犻 狌 犿）。标准产毒真菌菌株：纯绿青霉（犘 犲 狀 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿狏 犻 狉 犻 犱 犻 犮 犪 狋 狌 犿）、桔青霉（犘 犲 狀 犻 犮 犻 犾 犾 犻 狌 犿犮 犻 狋 狉 犻 狀 狌 犿）、寄生曲霉（犃 狊 狆 犲 狉 犻 犵 犻 犾 犾 狌 狊犘 犪
5、狉 犪 狊 犻 狋 犻 犮 狌 狊）、杂色曲霉（犃 狊 狆 犲 狉 犻 犵 犻 犾 犾 狌 狊 狏 犲 狉 狊 犻 犮 狅 犾 狅 狉）。培养基和试剂除另有规定外，试剂均为分析纯，水为蒸馏水。肉汤培养基：参见。孟加拉红培养基：参见。察氏培养基：参见。产毒培养基：参见。营养琼脂培养基：参见。甘油水溶液。细菌菌种培养和芽孢悬浮液的制备 菌种培养将装有菌种的安瓶上部消毒后敲碎，加入少量肉汤培养基，使其溶解并移至肉汤管中混匀，置于 培养，再转接至另一肉汤管中 培养。将培养物接种于营养琼脂斜面，培养周，镜检，芽孢数达 以上时便可制备芽孢混悬液。芽孢混悬液的制备用适量灭菌生理盐水冲洗菌苔，然后将该菌液移至
6、离心管中，充分摇匀后于 犵离心 ，弃去上清液，再加入同样量的灭菌生理盐水，摇匀后 水浴中加热 ，然后于 犵离心 ，取上清液并转入灭菌试管中，即为芽孢悬浮液，稀释并测定浓度，置于冰箱中保存。检验步骤 接种培养 样品制备精确称取（或吸取 ）有代表性的样品，放入装有 无菌水的三角瓶或广口瓶中，振荡 ，然后 倍递增稀释至所需要的浓度。分离培养用灭菌吸管吸取样品液放入平皿内，加入 溶化并冷却到 的孟加拉红琼脂充分混匀，置 培养箱中培养。选择培养（点种法）挑取孟加拉红培养基上生长的可疑菌落转接于察氏培养基上（从一个菌落挑取分别接种一点或三犛 犖犜 点），于 培养，观察菌落的大小、形态、特征或孢子的形态特征
7、、颜色、气味、溢水等。小室培养法（载片培养法）对产生极小而易碎的分生孢子梗的真菌，可用小室培养法对菌丝和子实体着生状态进行观察。取直径约为 的圆形滤纸一张，铺于直径 的培养皿底部，放一 形玻璃棒于滤纸上，其上平放一个洁净的载玻片，盖好培养皿后灭菌。吸取 加热熔化的察氏培养基，注入另一灭菌培养皿中，使其凝成薄层，用解剖刀无菌地把琼脂切成 的正方形，并将此正方形琼脂片移置已备好的载玻片中央，用接种针从孟加拉红琼脂平板上转将可疑菌接种在琼脂边缘，然后将盖玻片覆盖在琼脂上。为了防止在培养过程中琼脂干燥，可于滤纸上加注 灭菌的 甘油液，置于 温箱中，即成为小室保温培养。培养，直接在低倍显微镜下观察菌株生
8、长的细微结构、特征，进行描绘并做好详细记录。鉴定根据菌落形态，特征及孢子或子实体的细微结构，按照 中检索表，初步鉴定出真菌的属名或种名。产毒判定 产毒培养将长有符合形态菌及长有标准菌株的孟加拉红琼脂无菌操作切成，小块，分别接种于两瓶装有 产毒培养液的 三角瓶中，于 培养周后开始测毒。过滤取 培养后的产毒培养液在无菌条件下用单层定性滤纸过滤，滤液置于冰箱待测，剩余的培养液盖好棉塞继续培养。抑菌培养将熔化并冷却至 的察氏培养基中加入适量的芽孢悬液后（的巨大芽孢杆菌悬液按加入）充分混匀，然后每个灭菌培养皿中倾注 ，凝固后每皿中按对角线位置加放牛津杯个，两个对角线位置分别加满标准产毒培养滤液及未接菌的
9、产毒培养液，另两个对角线位置滴加待测样品的滤液，每个样品平行做两套平板，于 培养。判定结果 菌属鉴定结果根据 中鉴定出真菌的属名或种名报告结果。毒素检出结果标准产毒菌株滤液产生清晰的抑菌圈，且直径平均值（未接菌的空白培养液无抑菌圈）时测量样品滤液，培养周后开始测毒直至第 天。本方法的测定低限为 。测量直径平均值 报告产毒阳性。无抑菌圈或其直径 报告产毒阴性。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）检验流程图图犃 产毒青霉属、曲霉属及其毒素的检测流程图犛 犖犜 附录犅（规范性附录）培养基与试剂犅 制备要求为保证培养基的质量，应按 和 进行培养基的制备与性能测试。若使用商售的脱水合成培养基，应选用国内外通过
10、 质量体系认证生产厂商的产品并按其说明制备和使用。犅 营养肉汤犅 成分蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 蒸馏水 犅 制备将上述成分混合，溶解后调整 ，高压灭菌 。犅 孟加拉红培养基犅 成分蛋白胨 葡萄糖 磷酸二氢钾 硫酸镁 琼脂 孟加拉红溶液 氯霉素 蒸馏水 犅 制备将各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。另用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中，分装后，高压灭菌 。犅 察氏培养基犅 成分硝酸钠 犛 犖犜 磷酸氢二钾 硫酸镁 氯化钾 硫酸亚铁 蔗糖 琼脂 蒸馏水 犅 制备加热溶解，分装后 高压灭菌 。犅 产毒培养基犅 成分胰消化酪蛋白 蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 氯化钙 硫酸镁 菸酸 蒸馏水 犅 制备将各成分加入蒸馏水中，混匀，溶解后调整 ，高压灭菌 。犅 营养琼脂犅 成分蛋白胨 牛肉膏 氯化钠 琼脂 蒸馏水 犅 制备将除琼脂以外的各成分混合溶解于蒸馏水中，溶解后调整 ，加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化。高压灭菌 。犛 犖犜