1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 牛病毒性腹泻 粘膜病检疫规范犙 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲狆 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 犳 狅 狉犫 狅 狏 犻 狀 犲狏 犻 狉 犪 犾 犱 犻 犪 狉 狉 犺 犲 犪犿 狌 犮 狅 狊 犪 犾 犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布前言本标准代替 牛病毒性腹泻粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程 和 牛病毒性腹泻粘膜病病毒分离操作规程。本标准的附录和附录均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入
2、境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、张体银、袁文泽、简中友、董志珍、霍蕾。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：；。犛 犖犜 牛病毒性腹泻 粘膜病检疫规范范围本标准规定了牛病毒性腹泻检疫规范。本标准适用于牛病毒性腹泻的病毒分离鉴定、病毒抗原检测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其
3、最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和试验方法疾病概述牛病毒性腹泻（，）是由牛病毒性腹泻病毒（，）引起的一种以腹泻为临床特征的传染病，可导致怀孕母牛的流产、死胎、致畸或新生犊牛的持续感染，它具有高度传染性，但症状和病变较轻，发病率高而死亡率低。粘膜病（，）也是由 引起的一种以牛的急性型口腔、消化道粘膜发炎、糜烂、溃疡为特征的传染病。它和牛病毒性腹泻是同一病原引起，但表现不同的临床症状，发病动物口腔，特别是沿齿龈边沿糜烂，还可出现流泪和大量流涎。该病传染性不高，临床症状明显，发病率低，而死亡率很高。其病原、流行病学、症状、发病机理和病理变化、检疫及诊断参见附录。检疫方法 病毒分离和鉴定 仪器
4、试剂 倒置荧光显微镜。二氧化碳培养箱。标准细胞培养瓶，孔平底细胞培养板，带盖湿盒。无 抗体胎牛血清，细胞分散液。标准毒株（或 ）和标准阳性血清，荧光抗体，酶标抗体。细胞：使用 细胞或三代以内未感染 病毒的胎牛肾细胞（）。溶液及细胞培养液：配制参见附录。样品的采集 对于牛群、种牛的检疫，应无菌采集血液或者精液。对于怀疑为死于病毒性腹泻的牛，应采集血凝块和肠系膜淋巴结。对于流产、死胎牛的检疫，应采集胎儿的组织。样品的处理 血液用常规方法分离血清，血凝块应冻融次后，取析出的上清液。精液冻融次（或超声波裂解）后，按规定稀释，离心取上清液。动物组织加 倍体积含有 双抗的细胞培养液研磨，离心取上清液。犛
5、犖犜 样品的培养 取生长良好，形成 以上单层的 细胞，倒去培养液，接种处理好的样品，每瓶接种，每个样品接种个细胞瓶，同时直接接种样品稀释液作为阴性对照。置 二氧化碳培养箱吸附 。倒去样品，加入维持液，二氧化碳培养箱培养。收获病毒，同一样品瓶混合，放至 冻融次后进行下一步鉴定。荧光抗体法鉴定 将生长良好的细胞，用细胞分散液处理后，制备成 个 的细胞悬液，加入 孔细胞培养板内，每孔 ，置 培养。待细胞生长成 的单层，吸出孔内培养液，接种样品培养物，每孔 ，每个样品个孔。阴性、阳性和空白细胞对照方法同待检样品培养物。置 二氧化碳培养箱吸附 。吸出各孔内所加的待检和对照样品，加入维持液，每孔 ，置 二
6、氧化碳培养箱培养。弃掉 孔培养板内的培养液，用磷酸盐缓冲液（）漂洗自然干燥后，用 丙酮固定 ，用 洗次，自然干燥。取固定好的 孔培养板，每个待检样品及阴性、阳性和空白细胞对照孔分别加入 阳性血清各孔，每孔 ，置 作用。弃掉板孔内的 阳性血清，在所有板孔内加入工作浓度的 荧光抗体 ，放进湿盒，作用。用 洗次，倾去液体，自然干燥。镜检。结果判定阳性对照在显微镜下胞浆呈黄绿色，并见有黄绿色荧光的细小颗粒散布于胞浆内；阴性对照、空白对照无荧光。如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔荧光较亮，形态清晰，而经过阳性抗体抑制的同一样品无荧光，则判为阳性。如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔荧光微弱，形态不清晰，经过阳
7、性抗体抑制的同一样品无荧光，为可疑，需重检。重检后细胞孔仍然荧光微弱，形态不清晰，则判为阳性，重检后无荧光则判为阴性。如果阳性对照无特异性荧光，则试验失败，应重新检测。免疫过氧化物酶单层法（犐 犘犕犃）鉴定 取 固定的 孔板，弃掉板孔内的 阳性血清，在所有板孔内加入工作浓度的 酶标抗体 ，放进湿盒，作用。弃去板中液体，用洗液洗板次，每次 ，最后在吸水纸上轻轻拍干。每孔加入显色底物溶液 ，封板于室温（）下感作 。弃去板中液体，洗涤次，方法同 ，再用三蒸水洗涤次，最后在吸水纸上轻轻拍干，待检。结果判定与解释将 孔板置于倒置显微镜判读。阳性对照在显微镜下细胞浆（可能仅见于部分细胞）出现弥漫状或团块状
8、棕红色着染，阴性对照、空白对照无棕红色着染。如果没有经过阳性抗体作用的细胞孔出现棕红色着染，而经过阳性抗体抑制的同一样品无棕红色着染，则判为阳性。如果对照不成立，则试验失败，重新检测。犛 犖犜 微量血清中和试验 仪器试剂 溶液及细胞培养液：参见附录。标准毒株（或 ）和标准阳性、阴性血清。细胞：使用 细胞或三代以内未感染 病毒的胎牛肾细胞（）。被检血清：无菌自牛静脉采血，分离血清编号后备用。本方法使用的阳性血清、阴性血清和被检血清应经过、灭活处理。无 抗体胎牛血清，细胞分散液。标准细胞培养瓶，孔无菌细胞培养板，、微量可调移液器。倒置光学显微镜。二氧化碳培养箱。种毒的制备将 标准毒用维持液作 倍稀
9、释，取长成良好单层的细胞，用 洗次后，按培养液十分之一的量接种病毒，置 作用 ，加入维持液，二氧化碳培养箱培养至 细胞出现病变，收获病毒，放至 冻融次或者超声波（）裂解个循环，每次，冰浴，离心 ，取上清液，分装小瓶，置 保存备用。病毒的毒力测定将制备的标准病毒抗原，用维持液作 倍递增稀释至，每个滴度接种细胞培养板个孔，每孔，随后每孔加入细胞悬液（）和细胞维持液。同时每板设孔细胞对照。置 二氧化碳培养箱，逐日观察至，记录细胞病变，按 或 方法计算细胞半数感染量（）。操作程序 阴性血清对照：每孔加阴性血清、的病毒悬液，设孔。阳性血清对照：每孔加阳性血清、的病毒悬液，设孔。被检样品：在定量试验中，先
10、将被检血清用维持液作、连续倍比稀释至后加到 孔板中，每一稀释度孔，每孔，然后每孔再加 的病毒悬液。在定性试验中，将被检血清增加一个稀释度即稀释，其他步骤与定量方法相同。被检样品毒性对照：每孔加被检血清原样 ，设孔。细胞对照：每孔加 维持液，设孔。病毒回归对照：将 病毒稀释成 、，每个稀释度孔，每孔加病毒悬液，维持液。以上对照和被检样品置 温箱中作用后，每孔加入 个 细胞悬液 ，置 二氧化碳培养箱培养。结果判定在 二氧化碳培养箱培养第天开始观察结果，连续观察天判定结果。当病毒用量在 范围内，阴性血清对照出现典型细胞病变，阳性血清对照无细胞病变，被检血清对细胞无毒性，细胞对照正常，证明试验成立，可
11、以进行结果判定，否则，试验不成立，予以重做。判定标准在定量试验中，按 或 方法计算半数保护量（），即为该血清的中和效价。在定性试验中，被检血清在稀释度时有两个或两个以上孔的细胞完全被保护，该血清即为犛 犖犜 阳性。抗原捕获酶联免疫吸附试验 试验材料牛病毒性腹泻粘膜病抗原捕获 诊断试剂盒保存。试剂盒内应包括的物品如下：牛病毒性腹泻粘膜病病毒多克隆抗体包被板；抗 单克隆检测抗体；阳性对照血清；阴性对照血清；辣根过氧化物酶（）标记的牛抗鼠抗体；样品稀释液；浓缩洗液；底物溶液；终止液。样品的准备 组织样品使用尽可能新鲜的组织样品，组织可在保存一个月或长期冷冻保存，样品最好为扁桃体、脾脏、小肠及肺脏，用
12、剪刀将 样品剪碎（），将剪碎的样品置于 离心管中，加入 样品稀释液（），混匀，室温感作，离心 ，上清液作为检测样品备用。外周血液白细胞将肝素或 抗凝血样 ，离心 。用 移液器吸取沉淀表层的淡黄色液体，重悬于 样品稀释液中，每个样品换一个吸头。置室温，期间涡旋振荡数次，离心 ，上清液作为检测样品备用。如果样品的压缩细胞体积非常小，则用所有的血细胞来操作（包括红细胞），将细胞转移到 离心管中，并加入等体积 预冷的 的氯化铵（）溶液，置室温 。加入预冷的超纯水（或双蒸水）适量，轻轻翻转摇匀，离心 。弃去上清液，加入 样品稀释液（）到血细胞中，每个样品使用新的吸头，涡动混匀，置室温，期间涡旋振荡数次。
13、离心 ，上清液作为检测样品备用。鼻拭子将拭子放入底部有小孔的微型离心管中（可用热针头打空），并将微型离心管放入另一个 管中，离心 。弃去底部有小孔的微型管，并在 管中加入与获得样品等体积的样品稀释液（），混匀，室温下放置，期间振荡数次。离心 ，上清液作为检测样品备用。细胞培养物将细胞培养物 离心 ，弃去上清液；加入 样品稀释液，轻轻振荡混匀，置于室温，作为检测样品备用。仪器与设备酶标仪（波长 或双波长 ），振荡器，高速台式离心机，冰箱，温箱，道或 道洗头洗板机，道或 道移液器（），单道移液器（；和 ），吸头（；），管。试剂准备试剂盒各组分在使用前恢复至室温（）；溶液（提取白细胞用）；洗涤液：用
14、蒸馏水将浓缩洗液稀释 倍（），混匀备用。稀释用蒸馏水应符合 的要求。操作程序 加抗 单克隆检测抗体：用道或者 道移液器在酶标板每孔中加入 抗 单克隆检测抗体（试剂盒提供）。对照：加 阴性对照血清至酶标板的、孔；加 阳性对照血清至、孔。加样：在酶标板的其他相应孔中各加入 已稀释好的被检样品。感作：将酶标板封板后，在振荡器上混合 后，置下过夜感作 或犛 犖犜 下感作。洗涤：弃掉各孔液体，每孔加入 已稀释好的洗涤液，轻轻振动后甩掉，连续洗涤次。最后一次洗涤后，将酶标板在吸水纸上轻拍，除去孔内剩余的液体。加酶标结合物：每孔加入 辣根过氧化物酶（）标记的牛抗鼠抗体。感作和洗涤：将酶标板封膜后，置室温下，
15、感作 。重复 洗涤。加底物：每孔加入 底物溶液。感作：将酶标板置 下黑暗处感作 ，从加完第一孔开始计时。加终止液：每孔加 终止液，终止颜色反应。测定吸光值（）：酶标仪以空气作为空白对照，于 内，在 波长下测量和记录样品和对照的 值。试验有效性检测只有在阳性对照孔所得的平均值减去阴性对照孔所得的平均值大于 ，且阴性对照孔所得的平均值小于 时，测定结果才有效。结果计算和判定 结果计算按式（）、式（）和式（）计算结果：（）（）式中：阴性对照血清孔 值的平均值；孔阴性对照血清的 值；孔阴性对照血清的 值。（）（）式中：阳性对照血清孔 值的平均值；孔阳性对照血清的 值；孔阳性对照血清的 值。（）（）（）
16、式中：被检血清 值与标准阳性血清 值的比值；样品孔的 值；阳性对照血清孔 值的平均值；阴性对照血清孔 值的平均值。结果判定如果值小于 ，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病阴性；如果值介于 和 之间，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病可疑，应重新检测；如果值大于等于 ，样品判为牛病毒性腹泻粘膜病阳性。犛 犖犜 附录犃（资料性附录）疾 病 概 述犃 牛病毒性腹泻粘膜病（犫 狅 狏 犻 狀 犲狏 犻 狉 犪 犾 犱 犻 犪 狉 狉 犺 犲 犪犿 狌 犮 狅 狊 犪 犾 犱 犻 狊 犲 犪 狊 犲，犅 犞 犇犕犇）牛病毒性腹泻粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒（，）引起的一种以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻为特征的传染病。犃 病原 属于黄病毒科（）瘟病毒属（犘 犲 狊 狋 犻 狏 犻 狉 狌 狊），有囊膜的单股正链 病毒，核衣壳为非螺旋的 面体对称结构，直径约 ；病毒基因组长度约为 ，含有一个大的开放阅读框（），可被靶细胞核糖体转译成一个近 个氨基酸残基的前体蛋白，进一步由病毒和细胞肽酶加工产生至少种蛋白多肽。基因顺序为 （）。其中核衣壳蛋白 （）和糖蛋白 （）、（）、（）为病毒结构蛋白。本病毒对乙醚、三氯甲烷、胰酶等敏