1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 食品中致病菌检测方法实时犘 犆 犚法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳狆 犪 狋 犺 狅 犵 犲 狀 狊 犻 狀犳 狅 狅 犱犚 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犘 犆 犚 犕 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准的附录、附录均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国
2、深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：曹际娟、卢行安、肖性龙、李苏龙、孙杰、李丽、许业莉、顾鸣、谢昭聪、朱海、张经纬。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。犛 犖犜 食品中致病菌检测方法实时犘 犆 犚法范围本标准规定了食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌 、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的实时 检测方法。本标准适用于食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌 、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌的快速检测。规
3、范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。分析实验室用水规格和试验方法 实验室生物安全通用要求 出口食品中沙门氏菌检验方法 出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法 出口食品中副溶血性弧菌检验方法 出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法 出口食品中空肠弯曲菌检验方法 进出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法 进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌 检验方法 出口食品中霍乱弧菌检验方法
4、 食品中致病性弧菌的检测和计数定义、术语和缩略语下列定义、术语和缩略语适用于本标准。定义和术语 实时荧光犘 犆 犚 狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲 犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 狀 狋犘 犆 犚实时荧光聚合酶链式反应。犆 狋值 犮 狔 犮 犾 犲 狋 犺 狉 犲 狊 犺 狅 犾 犱犆 狋每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。缩略语 犘 犆 犚狆 狅 犾 狔 犿 犲 狉 犪 狊 犲 犮 犺 犪 犻 狀狉 犲 犪 犮 狋 犻 狅 狀聚合酶链反应，简称 。犛 犖犜 犇 犖 犃犱 犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犾 犲 犻 犮犪 犮 犻 犱脱氧核糖核酸。犱 犖 犜 犘犱
5、犲 狅 狓 狔 狉 犻 犫 狅 狀 狌 犮 犾 犲 狅 狊 犻 犱 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧核苷酸三磷酸。犱 犃 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犪 犱 犲 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧腺苷三磷酸。犱 犆 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犮 狔 狋 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧胞苷三磷酸。犱 犌 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 犵 狌 犪 狀 狅 狊 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧鸟苷三磷酸。犱 犜 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狋 犺 狔 犿 犻 犱 犻 狀 犲 狋
6、 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧胸苷三磷酸。犱 犝 犜 犘犱 犲 狅 狓 狔 狌 狉 犻 犱 犻 狀 犲 狋 狉 犻 狆 犺 狅 狊 狆 犺 犪 狋 犲脱氧鸟苷三磷酸。犝 犖 犌狌 狉 犪 犮 犻 犾犖 犵 犾 狔 犮 狅 狊 狔 犾 犪 狊 犲尿嘧啶犖糖基化酶。犜 犪 狇犜 犺 犲 狉 犿 狌 狊 犪 狇 狌 犪 狋 犻 犮 狌水生栖热菌。犜 狉 犻 狊 狋 狉 犻 狊（犺 狔 犱 狉 狅 狓 狔 犿 犲 狋 犺 狔 犾）犪 犿 犻 狀 狅 犿 犲 狋 犺 犪 狀 犲三（羟甲基）氨基甲烷。犉 犃犕 犮 犪 狉 犫 狅 狓 狔 犳 犾 狌 狅 狉 犲 狊 犮 犲 犻 狀 羧基荧
7、光素。犜 犃犕犚 犃 犮 犪 狉 犫 狅 狓 狔 狋 犲 狋 狉 犪 犿 犲 狋 犺 狔 犾 狉 犺 狅 犱 犪 犿 犻 狀 犲 羧基四甲基罗丹明。测定方法 方法提要在 基础上，加入一条与模板 匹配的、两端有荧光基团标记的寡核苷酸探针。每进行一次循环，合成的新链数与释放的荧光基团数呈对应关系，即 产物的量与荧光信号的强度呈对应关系。当荧光信号超过所设定的阈值（）时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光基团的增加量可以间接地体现目的片段的扩增量。犛 犖犜 样品的模板 进行实时 扩增，观察实时 的增幅曲线，从而对食品中的致病菌进行快速检测。设备和材料 实时 仪。离心机。微量移液器和灭菌吸头：，。恒温
8、培养箱。恒温水浴锅。天平。均质器或乳钵。灭菌三角烧瓶：，。灭菌吸管：。灭菌平皿：。灭菌试管：内径，长。接种棒、镍铬丝。试管架、试管篓。废液缸。试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。所有试剂均用无 酶污染的容器分装。水：应符合 中一级水的规格。犜 犪 狇 聚合酶。：、。提取试剂：称取 粉末，加入 灭菌蒸馏水中，摇匀即可，也可使用商业化的 提取试剂盒。缓冲液：（），氯化钾（）氯化镁（）。引物和探针：引物和探针序列见表，其中探针的 端标记，端标记 。检测步骤 样品制备、增菌培养和分离沙门氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照 进行。金黄色葡萄球菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照
9、 进行。小肠结肠炎耶尔森氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照 进行。食品中单核细胞增生李斯特氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照 进行。空肠弯曲菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照 进行。肠出血性大肠杆菌 的样品制备、增菌培养和分离步骤参照 进行。副溶血性弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照 进行。霍乱弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照 进行。创伤弧菌和溶藻弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤参照 进行。模板犇 犖 犃的制备 增菌液模板犇 犖 犃的制备取 中培养的相应致病菌增菌液（需二次培养的则取二次增菌液），加到 无菌离心管中，离心 ，吸弃上清；加入 提取液（使用前室温解冻并充分混匀
10、，快速吸取），混匀后沸水浴 ，离心 ，取上清保存于 备用以待检测。犛 犖犜 可疑菌落模板犇 犖 犃的制备挑取 中分离到的可疑菌落或菌体，加入 提取液，再按照 步骤制备模板 以待检测。也可使用商业化的 提取试剂盒并按其说明制备模板。实时犘 犆 犚检测 反应体系体积为：缓冲液、引物对（）各、（）、犜 犪 狇 聚合酶（）、水、模板。反应条件：，预变性 ，变性，退火延伸，同时收集 荧光，进行 个循环，保存反应产物。注：反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。检测过程中分别设阳性对照、空白对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子 或阳性菌株，空白对照为无菌水。结果及判断 质控标准 阴性对照：无扩
11、增曲线，犆；阳性对照：出现典型的扩增曲线，犆值应 。否则，实验视为无效。结果判定和报告 犆值，可判定样品结果为阴性，可直接报告未检出相对应致病菌；犆值 ，可判定该样品结果为阳性；犆值 而，建议样本重做。重做结果犆值 者为阴性，否则为阳性。对于阳性结果，应参见规范性引用文件中的方法或相关的国际权威微生物经典检验方法做进一步的生化鉴定和报告。测定低限在上述条件下，本方法对于各致病菌的测定低限见表。表食品中 种致病菌的测定低限致病菌名称测定低限（）沙门氏菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 致病菌名称测定低限（）肠出血性大肠埃希氏菌 副溶血性弧菌 霍
12、乱弧菌 创伤弧菌 溶藻弧菌 废弃物处理和防止污染的措施检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理。检测过程中防止交叉污染的措施见附录。生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测致病菌，所有培养物应小心处置。并参见 中的有关规定执行。犛 犖犜 附录犃（规范性附录）食品中致病菌实时犘 犆 犚检测所用引物和探针序列表犃 食品中致病菌实时犘 犆 犚检测所用引物和探针序列致病菌名称引物序列探针序列沙门氏菌 志贺氏菌 金黄色葡萄球菌 小肠结肠炎耶尔森氏菌 单核细胞增生李斯特氏菌 空肠弯曲菌 （）肠出血性大肠埃希氏菌 副溶血性弧菌 霍乱弧菌 创伤弧菌 溶藻弧菌 犛 犖犜 附录犅（规范
13、性附录）检测过程中防止交叉污染的措施犅 抽样和制样过程抽样和制样工具必须清洗干净，经 高压灭菌 。一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。犅 检测过程犅 实时 实验室应分为样品制备区、前 区（反应混合物配制区）、区（检测区）。将模板提取、反应液配制、循环扩增等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单向进行。犅 实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。犅 各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。犅 所有溶液、水、耗材和器具要 、高压，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使
14、用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在 贮存的试剂中，可加入 的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。犅 模板或引物的离心管打开之前，要简短离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。犅 前 区中，最好能在 操作箱中加入 反应各组分。犅 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的。犅 可使用酶和 系统控制污染。犅 应遵循 操作的其他要求。犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准食品中致病菌检测方法实时犘 犆 犚法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京复兴门外三里河北街 号邮政编码：网址 电话：中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号：定价 元