1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 代替 牛地方流行性白血病检疫技术规范犘 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 狅 犳狇 狌 犪 狉 犪 狀 狋 犻 狀 犲 犳 狅 狉犲 狀 狕 狅 狅 狋 犻 犮犫 狅 狏 犻 狀 犲 犾 犲 狌 犽 狅 狊 犻 狊 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准代替 牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程。本标准与 相比，主要变化如下：标准名称改为 牛地方流行性白血病检疫技术规范；增加了临床诊断部分；实验室诊断增加了病原分离鉴定、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和核酸检测方法：对已有的琼脂凝胶免疫扩散试验的操作
2、方法和结果判定进行了修订完善。本标准的附录、附录、附录均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：乔彩霞、张鹤晓、赖平安、高志强、吴丹、蒲静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：。犛 犖犜 牛地方流行性白血病检疫技术规范范围本标准规定了牛地方流行性白血病临床诊断和实验室诊断的操作内容。本标准适用于牛地方流行性白血病的检疫。规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方
3、研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程缩略语下列缩略语适用于本标准。犈 犅 犔牛地方流行性白血病。犅 犔 犞牛白血病病毒。犉 犅 犔胎牛肺。犚 犐 犃放射性免疫试验。犘 犆 犚聚合酶链反应。犃 犌 犐 犇琼脂凝胶免疫扩散。犈 犔 犐 犛 犃酶联免疫吸附试验。临床诊断 流行病学牛感染 后将终生带毒，成为传染源，其传播方式有垂直传播和水平传播两种。该疫病自 年发现于德国以来，目前在德国、波兰、罗马尼亚和前苏联等多数国家均有发生，而与我国近邻的犛 犖犜 日本也因输入性传播导致该病在全国蔓延。临床症状牛白血病的潜伏期较长
4、，可达年年，多数感染牛不呈现临床症状，以在血液中存在白血病抗体并出现持续的淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞为特征。疫病发展形成肿瘤后则出现淋巴结肿大和一些组织脏器的生理机能障碍，并表现体重减轻、贫血和泌乳减少等症状。病理变化感染 后，病牛会出现淋巴结肿大，遍及全身各个脏器，形成大小不等的结节性或弥漫性肉芽肿病灶。特别是真胃、心脏和子宫等为最常发的器官。根据流行病学、临床症状和病理变化可作出牛地方流行性白血病的初步诊断，进一步的确诊有赖于实验室诊断。实验室诊断 病原分离及鉴定 原理 是一种外源反转录病毒，其主要靶细胞是 淋巴细胞。不仅以前病毒的形式存在于感染牛的血液淋巴细胞和肿瘤细胞中，而且存在于动
5、物体的各种体液（鼻腔、支气管渗出液，唾液和牛奶等）中，利用外周血液血淋巴细胞可对其进行培养分离，然后用电镜或 抗原测定法鉴定。也可直接用 检查外周血和肿瘤中存在的 前病毒 。材料准备 器材和设备：无菌注射器，倒置光学显微镜，二氧化碳培养箱，冰箱（保存血清，保存种毒），无菌 孔细胞培养板，微量可调移液器（、），微量滴头，吸管（、）。试剂：淋巴细胞分离液、胎牛血清的 培养液和细胞分散液配制见附录。胎牛肺细胞：无菌采取出生犊牛肺，磨碎或剪碎，再用胰蛋白酶消化制备细胞，置 二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。样品制备 样品采集用无菌注射器或采血专用真空管针无菌从牛静脉采血并加入抗凝剂，采集样品立即放入
6、冰箱保存，在 内送到实验室。样品处理取 抗凝血，轻轻加入等量的淋巴细胞分离液，注意不要摇动打乱液层，离心 ，离心后分成多层，最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞，在血浆层与分离液之间是一层较致密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放入另一离心管中，以 洗涤后备用。病毒分离取 得到的淋巴细胞与 细胞在 含 胎牛血清的 中共同培养，置于 二氧化碳培养箱，逐日观察细胞变化，并在后收获培养物上清，保存于 待鉴定。病毒鉴定病毒 致 细 胞 变 化 特 点 是 细 胞 产 生 合 胞 体。取 上 述 细 胞 培 养 物，经 冻 融、裂 解 两 次 后，以 离心 ，取上清通过 、或 等
7、方法检测其中是否含有 和 抗原，并通过电子显微镜观察上清中包含的病毒粒子，或者用 方法检测上清中的 前病毒核酸（方法见 ），从而确诊样品中是否包含有 。犛 犖犜 血清学试验 琼脂凝胶免疫扩散试验 原理抗原及其特异性抗体在凝胶中呈自由扩散形式，不同抗原在凝胶中的扩散速度不同，当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，其相对分子质量增大，因而不再继续扩散而形成沉淀，呈现出线状，称为免疫沉淀线或免疫沉淀带。即根据抗原与阳性血清之间出现的沉淀线来判定被检血清中是否存在特异性抗体。材料准备 器材和设备：吸管、量筒、量杯、三角瓶、平皿（直径）、孔梅花样金属打孔器（内径）、微量移液器（，），
8、观察灯，温箱（）。试剂：（）和琼脂糖凝胶平板配制方法见附录。标准抗原：由指定单位提供。由感染 病毒的胎羊肾细胞（）培养液经提取和浓缩制成，是以病毒囊膜糖蛋白（）为主，并含核蛋白（）的混合抗原，试验时与阳性血清之间应在 内出现清晰的沉淀线，与标准阴性血清之间不得出现任何沉淀线。标准阳性血清：由指定单位提供。能与标准抗原在 内产生明显的细直而致密的一条沉淀线（抗体），末端接触两侧相邻孔的边缘。样品制备被检血清，用无菌注射器或采用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清后编号，样品应无溶血，经 灭活处理，保存于，时间不宜超过周。操作方法 打孔按图和图的模式在制备好的琼脂板上打孔，孔径为，孔间距，反应孔
9、现用现打。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出，切勿损坏边缘以及使琼脂层脱离平皿，为防止渗漏，最好封底。图图犛 犖犜 加样七孔型（如图所示），中央孔加抗原（），、孔加标准阳性血清，、孔分别加三份被检血清；六十三孔型（如图所示），按图“”孔加抗原。“”孔加标准阳性血清，数字孔加被检血清（同时可检查 份样品）。每孔均以加满不溢出为度，约 孔，每加一个样品应换一个吸头。反应加样完毕后，静置 ，将平皿水平倒置，放入湿盒，置于 作用，分别在、和 观察并记录结果。结果判定 判定方法将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立。判定标准阳性：出现清晰致密的沉淀
10、线，并与标准阳性血清的沉淀线末端相融合（如图所示孔）。被检血清可能在此沉淀线的外侧，还出现粗而直的第二条沉淀线，这是沉淀线（核蛋白 与其特异性抗体形成的沉淀线）（如图所示孔）。图弱阳性：不出现沉淀线，但两侧标准阳性血清形成的沉淀线末端向被检血清孔弯曲（如图所示孔）。凡弱阳性者应重复试验一次，如仍为弱阳性则判为阳性，否则判为阴性。阴性：不出现沉淀线，且相邻孔的标准阳性血清形成的沉淀线直伸到被检血清孔的边缘（如图所示孔）。非特异性反应：出现的沉淀线粗而浑浊并与标准阳性血清形成的沉淀线交叉并直伸，为非特异反应（如图所示孔）。应重新试验，若仍出现非特异反应则判为阴性。间接酶联免疫吸附试验 原理利用抗原
11、抗体的特异性反应，用 抗原直接包被微量反应板，或先用 多克隆或者单克隆抗体进行包被之后捕获所加入的 抗原，当待测的血清或奶样品中含有相应的特异性抗体时，则可与所包被的抗原相结合，并能继续与加入的酶标记的抗牛 抗体结合形成复合物。随后加入的底物可在酶分子的作用下呈现颜色反应，颜色反应的深浅可与样品中相应抗体的量呈正比，通过酶标仪可检测颜色反应的光密度值，从而判定待测样品中是否含有牛白血病病毒的特异性抗体（本标准只作定性用）。材料准备 器材和设备：孔微量反应板，酶标测定仪，单孔道或多孔道微量移液器，振荡器，恒温箱。所用溶液：包被液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液、底物显色液及终止液的配方详见附录，各种
12、试剂均为分析纯试剂。抗原：由指定单位提供。与 相同的制备方式从病毒感染的细胞培养液中提取，并用包被缓冲液稀释后用。犛 犖犜 标准阳性和阴性血清：由指定单位提供，使用时经 灭活处理。抗牛 抗体：由指定单位提供。样品制备被检血清：用无菌注射器或采用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清后编号，样品应无溶血，经 灭活处理，保存于，时间不宜超过周。被检奶样：所采集的奶样需在冰箱中放置 ，直至乳脂层形成，期间不能振荡；或者也可于 离心 使奶样形成乳脂层，在检测前，将所形成的乳脂层去除。操作方法 包被 抗原和阴性对照抗原分列依次包被微量反应板，每孔 ，过夜。洗涤取出包被过夜的酶标板，甩掉孔内的包被液，加入
13、洗涤液至反应孔的顶端，静置 或甩干，并用吸水纸沥干，如此重复次，也可用洗板机洗涤。封闭每孔加入 封闭液，置 温箱孵育 ，甩掉液体按 所述标准程序进行洗涤。加样及抗体吸附检测血清样品时，先在用于检测样品的反应孔中，每孔加入 稀释液。之后在 抗原包被孔和阴性对照抗原包被孔中分别加入待检血清样品，同时设阳性和阴性血清对照，每份样品需重复测定两孔。检测奶样时，将 待检奶样、阳性和阴性奶样分别加入 抗原和阴性抗原包被的两种反应孔中，每份样品需重复测定两孔。将加好样的酶标板在振荡器上充分振荡混匀后，孵育。加酶标二抗将上述反应板按 所述标准程序进行洗涤后，每孔加入用洗涤液稀释的辣根过氧化物酶（）标记的抗体
14、，孵育。显色将上述反应板按 所述标准程序进行洗涤后，每孔加入 底物显色液，室温孵育 。终止每孔加入 反应终止液，振荡混匀，加终止液的顺序应与加底物的顺序一致。测定 犗 犇值在反应终止后的 内，在酶标以上测定反应孔在 波长处的光吸收值（值）。结果判定 犗 犇值的校准每份样品在包被有 抗原的反应孔所测的 值减去其阴性抗原对照孔所测的 值即为该样品校准的 值（）。计算样品犘 犘值样品 值的计算见式（）：样品 值（）样品 阳性血清 （）判定标准检测结果中阳性对照的 值大于、阴性对照的 值小于 且阴性对照的 值小于临界值（血液样品为，奶样为），本次检测结果成立。如其中有一项不符则检测结果判为无效，犛 犖
15、犜 重新进行试验。血清样品：值小于 判为阴性，值大于等于 则判为阳性。奶样：值小于判为阴性，值大于等于则判为阳性。阻断酶联免疫吸附试验 原理用 多克隆抗体或单克隆抗体包被微量反应板，之后加入抗原，被抗体捕获的抗原进一步可与待检血清样品中的 抗体发生结合，从而阻断生物素标记 抗体与抗原的结合，而阴性样品则不会发生阻断，所结合的标记抗体促使底物发生反应，转变为可检测的信号。材料准备 器材和设备：同间接酶联免疫吸附试验。所用溶液：同间接酶联免疫吸附试验。抗原：同间接酶联免疫吸附试验。标准阳性和阴性血清：同间接酶联免疫吸附试验。多克隆或单克隆抗体：由指定单位提供。生物素标记 抗体和 标记亲和素：由指定
16、单位提供。样品制备被检血清：同间接酶联免疫吸附试验。操作方法 包被用碳酸盐缓冲液将 多克隆或单克隆抗体稀释后，每孔 ，过夜包被微量反应板。洗涤取出包被过夜的酶标板，按 所述标准程序进行洗涤。抗原捕获用洗涤缓冲液将 抗原稀释后，每孔 加入酶标板，孵育。加样将上述反应板按 所述标准程序进行洗涤后，将标准阳性和阴性血清用洗涤液按稀释后，每孔 加入酶标板，重复孔。待检的混合样品，如 分血清，用洗涤液作稀释后每孔加入 。待检的单一样品，则按 用稀释液稀释后每孔 加样。加样完毕后，在孵育。加生物素标记的抗体和酶标记的亲和素将反应板按 所述标准程序进行洗涤后，用含 胎牛血清的洗涤液将生物素标记的抗体稀释后，按每孔 加入酶标板中，孵育，按 所述标准程序进行洗涤。之后每孔加入 用洗涤液稀释的 标记的亲和素，置于摇床，在 孵育 。按 所述标准程序进行洗涤。显色和终止将反应板按 所述标准程序进行洗涤后，每孔加入 底物显色液，在暗环境下显色 ，之后加入 终止液终止反应，并在 内在酶标仪上测定 值。测定 犗 犇值在 波长处，使用空孔作为调零孔，并用测定样品的 值。其阴性对照样品的 值应位于 范围之内，否则应重新